基于质谱流式技术研究间充质干细胞移植对急性肝损伤小鼠的免疫调节机制

发布时间：2021-06-06 04:39

　　背景急性肝损伤（Acute Liver Injury,ALI）是由药物、毒物或病毒等物质引起的肝细胞变性、坏死,病情进展较快,可迅速发展为急性肝衰竭,内科综合治疗临床病死率高达70%。由各种病因导致的ALI,肝脏损伤程度远远大于病因本身造成的损伤。研究表明,ALI时肝细胞坏死激活了肝脏免疫系统,进一步加重了肝脏的损伤。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）具有免疫调节和促进肝损伤修复的作用。MSCs移植治疗ALI的疗效,已经在多种动物模型和临床试验中得到证实,有望成为新的替代治疗手段。研究表明MSCs主要通过调节多种免疫细胞的活化和功能发挥促进肝损伤修复的作用。但是,由于传统流式细胞术存在检测通道受限和荧光素发射光谱重叠的技术瓶颈,现在对于MSCs移植治疗ALI的免疫调节作用的研究主要局限在单个或几个免疫细胞亚群上。但是,免疫系统是由多种细胞和分子组成的动态网络,研究MSCs移植治疗ALI对整个肝脏免疫系统的调节作用是非常必要的。质谱流式技术由Tanner和他的同事在2009首次提出,突破了传统流式细胞术的技术瓶颈,采用金属同位素替代荧光素作为探针偶联抗... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：140 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

流式细胞术检测小鼠肝脏免疫细胞的纯度和活率(CD45+代表免疫细胞,PI-代表活细胞)。

我们选择了涵盖CD4+T细胞亚群、CD8+T细胞亚群、B细胞亚群、常驻肝脏NK细胞、传统NK细胞(Conventional NK,c NK)、浆细胞DC(plasmacytoid DC,pDC)、以及传统DC、单核巨噬细胞和粒细胞的谱系特异性表面标志物,以及功能分子:转录因子,如FOXP3;趋化因子受体,如CXCR3,CX3CR1;细胞因子受体,如CD127,CD25;协同刺激分子,如Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen-4(CTLA-4),ICOS;协同刺激分子配体,如CD80;粘附分子,如CD62L,CD44;细胞增殖标志物,如KI-67等共43个抗体,根据金属同位素在质谱流式机器上的信号强度和敏感性以及所检测抗体在免疫细胞上的丰度,以使通道之间信号干扰最小为原则,进行金属同位素和抗体匹配的通道设计(表1-1),然后使用MAXPAR×8抗体标记试剂盒偶联抗体与金属同位素,制备质谱流式抗体。将制备成功的质谱流式抗体调整至统一浓度,在100μL含有5×106个CD45+细胞EP管内依次加入1μL、0.5μL、0.25μL、0.125μL和0μL的抗体,以优化质谱流式抗体使用剂量。为了准确方便的进行质谱流式数据的分析比较,我们采用金属barcode对采用不同剂量抗体孵育的样本进行标记,同时上机检测和分析以减少技术误差。我们以可以明显区分阳性信号且使抗体用量达到饱和状态的最低剂量为最佳抗体使用剂量,例如:158Gd-CD3抗体使用剂量检测(图1-2),在抗体用量为1μL时,阳性信号与阴性信号区分最为明显,故在5×106个CD45+细胞/100μL的反应体系内158Gd-CD3抗体使用剂量为1μL。在5×106个CD45+细胞/100μL的反应体系中,每个抗体的具体使用剂量见表1-1。多色流式细胞术验证质谱流式的准确性

目前对于细胞表面标志物的检测主要依赖于流式细胞术,质谱流式技术目前还没有得到广泛的应用,因此我们用主要免疫细胞亚群(CD3+T细胞、CD19+B细胞、CD49b+NK细胞和CD11b+髓系细胞)谱系特异性标志物抗体,对肝脏免疫细胞分别进行质谱流式(图1-3A)和多色流式(图1-3B)检测分析,将质谱流式和多色流式检测到的T细胞、B细胞、NK细胞和髓系细胞占CD45+细胞的百分比进行比较,结果表明,两种检测手段所得的结果没有明显的统计学差异(如图1-3C)。手动设门验证高维数据分析方法的可行性


本文编号：3213626