AGR2基因在Barrett’s食管中的差异表达及其肿瘤生物学功能和机制的研究

发布时间：2021-06-21 14:13

　　第一部分携带短发卡RNA的逆转录病毒载体构建和鉴定及AGR2表达沉默的食管腺癌SEG1稳定细胞系的建立目的构建携带短发卡RNA（shRNA）的逆转录病毒载体，用该载体将shRNA导入SEG1细胞系，利用shRNA介导的RNA干扰（RNAi）沉默AGR2基因表达，建立AGR2表达沉默的SEG1稳定细胞系。方法利用美国冷泉港实验室RNA干扰数据库信息设计针对AGR2的三种shRNA。将shRNA序列克隆至重组小鼠逆转录病毒（LMP）质粒框架内。利用病毒包装细胞系制各携带shRNA的重组逆转录病毒。采用低速离心法将携带shRNA的重组逆转录病毒转染入SEG1细胞。用嘌呤霉素进行药物选择，建立稳定转录shRNA的SEG1细胞系。用实时定量PCR，Western-Blot法和细胞免疫化学DAB染色法从mRNA和蛋白水平比较三种shRNA抑制AGR2基因表达的程度。结果成功构建携带shRNA的重组逆转录病毒载体：LMPAG1、LMPAG2和LMPAG3，以及空载体病毒LMPER。逆转录病毒成功感染SEG1细胞。建立起稳定转录三种不同shRNA的SEG1细胞系。三种shRNA序列（AG1，AG2和A... 

【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：84 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

Xhol和Eco川双酶切质粒

若病毒成功感染SEGI细胞，则在荧光显微镜卜可观察到SEGI细胞表达GFP。在嘿吟霉素抗药性阳性筛选24h后，约一70%SEGI细胞感染了LM以Gl逆转录病毒并表达GFP(图3)。这表明逆转录病毒载体可在SEGI细胞内正常转录和表达，且相当高比例的SEGI细胞被成功感染。26

5ilencingefficieneyshownbyrealtimePCR604D20800一罗OO>一<2比E止闪O<LMPERLMPRAGILMPRAGZLMPRAG3定量PCR检测不同逆转录病毒载体感染的SEGI稳定细胞中为对照。


本文编号：3240823