HBV cccDNA定量检测方法的建立及临床初步应用

发布时间：2021-07-17 18:37

　　研究分为两个部分:一、HBV cccDNA定量检测方法的建立;二、乙肝病毒在慢性HBV感染者疾病不同阶段复制特点。一、HBV cccDNA定量检测方法的建立目的:建立一种特异性、敏感性高的乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBVcccDNA）的定量检测方法。方法:构建含HBV目的序列的重组质粒,利用HBV cccDNA的选择性引物/探针（简称71F）以及总HBV DNA引物/探针（简称13F）建立实时荧光定量PCR反应,分析其灵敏度、重复性和线性范围。进一步利用重组质粒、血清和肝组织DNA等不同模板优选最佳PCR扩增体系,其中依据模板的不同处理方法分为无酶切组、限制性内切酶酶切组、PSAD酶切组、限制性内切酶联合PSAD酶切组,比较各组对HBV cccDNA检测的特异性。结果:通过对已有特异性检测方法进行优化,并针对特异性引物扩增效率和PSAD酶切等环节进行详细探讨,所建立的荧光定量检测体系,HBV cccDNA特异性引物/探针及总HBV DNA引物/探针检测灵敏度均达到10²拷贝/ml,两对引物探针检测线性范围均为4×10²-4×10

【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校

【文章页数】：65 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

质粒构象

A﹃﹃︺图1一3.不同浓度质粒标准品的重复性分析。A为13F的重复检测标准品的扩增曲线;B为7lF的重复检测标准品的扩增曲线。1.2.2.3两对引物的扩增效率分析参照Livak等人比较目标序列和内参序列扩增效率的方法[‘41，利用13F与7lF在4x10”一4x102拷贝/mL范围内质粒标准品的Ct值(图1一2)，计算每一

cycleNUmberLogCOCD图1一2.扩增曲线和标准曲线。A、B分别为13F的扩增曲线和标准曲线;C、D分别为7lF的扩增曲线和标准曲线。基于重组质粒的扩增范围，13F与7lF的空白及阴性对照始终保持检测不到水平，因此，13F与7lF检测下限定为1护拷贝/mL。此后的定量检测采用4xl08一4x104拷贝/mL五个浓度制作标准曲线。1.2.2.2重复性分析批内重复实验:选择浓度为4x1o”~4x103拷贝/mL的梯度稀释质粒标准品，分别应用13F、7lF进行荧光定量PCR检测，每一浓度同时平行扩增3次，其Ct值的CV值分别为13F<3%、7lF<3%(图l一3)。批间重复实验:选择浓度为4xlo” ~4x103拷贝/mL的梯度稀释质粒标准品，每一浓度分别使用13F、71F进行7个不同批次的荧光定量PCR检测，其Ct值的CV值分别为13F<4%、71F<3%。1.倪刊刃!日.伍

【参考文献】：
期刊论文
[1]Lamivudine treatment of decompensated hepatitis B virus-related cirrhosis[J]. Fu-Kui Zhang Liver Research Center, Beijing Friendship Hospital, Capital University of Medical Sciences, Beijing 100050, China.  Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International. 2006(01)
[2]HBV感染者血清中HBVcccDNA、HBeAg及HBV DNA的关系[J]. 吕其军,魏秀桂,聂伟,李毅,田永刚,黄黎.  临床肝胆病杂志. 2005(04)
[3]乙型肝炎病毒cccDNA检测的方法与临床意义[J]. 赵克开,缪晓辉.  中华肝脏病杂志. 2005(04)
[4]HBV cccDNA in patients’ sera as an indicator for HBV reactivation and an early signal of liver damage[J]. Johnny Sze.  World Journal of Gastroenterology. 2004(01)
[5]慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞及肝组织中HBV cccDNA定量检测[J]. 郝勇,苗千里,缪晓辉,赵克开,李东良,林江,沈雪林.  中华传染病杂志. 2007 (01)
[6]乙型肝炎病毒感染的肝癌患者肝组织中乙型肝炎病毒cccDNA的检测[J]. 张涛,韩涛,高英堂,陈浩,杜智,王毅军.  中华肝脏病杂志. 2007 (03)



本文编号：3288715