Ca 2+ /CaMK Ⅱ信号通路调控ERS诱导人肝星状细胞凋亡的作用机制

发布时间：2021-08-04 11:49

　　目的应用钙调蛋白激酶Ⅱ（calmodulin kinase Ⅱ,Ca MK Ⅱ）抑制剂KN-62和三磷酸肌醇激动剂尿苷三磷酸（uridine triphosphate,UTP）作用于人肝星状细胞（Hepatic Stellate Cell,HSC）,观察HSC凋亡情况,旨在从内质网应激途径（Endoplasmic Reticulum Stress,ERS）探讨Ca MK Ⅱ对HSC凋亡的作用机制,为寻找治疗肝纤维化（Hepatic Fibrosis,HF）的新靶点提供科学依据。方法复苏液氮罐中的HSC,把生长良好的细胞均分为5组:空白对照组、转化生长因子β₁（Transforming growth factor beta-1,TGF-β₁）组、KN-62组、UTP组、KN-62+UTP组。空白对照组加无血清培养基培养24 h,TGF-β₁组加入5 ng/m L TGF-β₁培养24 h,其他三组在5 ng/m L TGF-β₁培养24 h之后,弃去培养基,KN-62组更换10μ... 

【文章来源】：华北理工大学河北省

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

KN-62及UTP作用HSC后调控ERS诱导细胞凋亡及其机制研究图

华北理工大学硕士学位论文-10-速冷冻离心机等。全程操作，均冰上进行。2）吸取各孔上清，移入EP管后，以3000rpm/min10min条件离心，取上清，避免触及底部颗粒和细胞碎片等。3）取出存放于4℃冰箱中的试剂盒置于常温条件下，用镊子夹取实验所需数量的酶标板板条。4）据实验要求，分为以下孔别：空白孔：样品、酶标试剂均不加，剩余操作相同；标准样品孔：加50μL标准品；待测样品孔：加40μL样品稀释液及10μL待测样品。加样操作需严谨，勿触及孔壁，加于孔底，轻晃混匀。5）封板膜密封各孔，37℃恒温条件，静置30min。6）稀释30x洗涤液至1x，备用。7）揭开封板膜，甩弃孔内液体，移液器吸取200μL1x洗涤液加至各孔，30s后甩弃，洗涤5次。8）加酶标试剂50μL于每孔（除空白孔），封板膜密封各孔，37℃恒温条件，静置30min。9）操作同7）。10）先后加入A、B显色剂各50μL，晃匀，37℃恒温条件下静置30min。11）加终止液50μL，15min内检测。12）以空白孔调零，450nm波长下，检测OD值。图2CaMKII标准曲线和回归方程1.2.7TUNEL法观察HSC凋亡1）取无菌玻片分别放于24孔板孔内，各孔加入已终止消化的HSC悬液500μL，

华北理工大学硕士学位论文-14-1.2.11WesternBlot法检测CaMKII、ERS蛋白GRP78、凋亡调控蛋白（Caspase-12、Caspase-3、Bcl-2及Bax）的表达1）提总细胞蛋白（1）4℃条件下预冷试剂、耗材及设备：PBS缓冲液、蛋白提取液、细胞刮、EP管、离心机等。全程操作，均冰上进行。（2）取出6孔板，PBS清洗细胞3次，每次尽量吸净底部残余液体。（3）加蛋白提取液至6孔板，每孔200μL，静置30min。（4）细胞刮朝同一方向刮下细胞，刮至板底透亮，刮净培养瓶各底角。（5）枪头吸取细胞，移入EP管中，标记，以12000rpm/min15min条件离心。（6）收集上清液，勿触及沉淀，移入新EP管并标记，随后保存于-80℃冰箱中。2）BCA法测定蛋白的浓度（1）混合适量1：50的A液和B液。（2）根据实验所需量，PBS稀释标准蛋白原液（25mg/mL），调整其工作液浓度为0.5mg/mL，避光保存，以备用。（3）取标准蛋白工作液0、1、2、4、8、12、16、20μL按序加至96孔板第1排，各组样品设定3个复孔。（4）取PBS20、19、18、16、12、8、4、0μL按序加至上述3）含标准蛋白工作液的孔内。（5）取待测蛋白2μL加至96孔板第4排，各组样品设定3个复孔，加18μLPBS于各待测蛋白孔。（6）加200μLBCA工作液于各孔，37℃条件下温育30min。（7）562nm波长下，测定OD值。（8）5x上样缓冲液和蛋白样品混合为1x浓度即止，以100℃5min条件加热，随后在-80℃条件下保存。图3BCA标准曲线和回归方程

【参考文献】：
期刊论文
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[3]晚期糖基化白蛋白通过激活caspase-12途径诱导巨噬细胞凋亡[J]. 李金国,郝奇,刘映雪,李鹏,邵夏炎,田华,方永奇,姚树桐.  生理学报. 2016(06)
[4]Grp78和caspase-12在缺氧心肌细胞中的表达[J]. 李蕊君,何昆仑,李鑫,胡国梁,刘春蕾,王莉莉.  军医进修学院学报. 2011(03)



本文编号：3321642