Locostatin对肝纤维化小鼠肝脏胶原代谢的影响

发布时间：2017-04-28 16:07

  本文关键词：Locostatin对肝纤维化小鼠肝脏胶原代谢的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是由各种致病因子如病毒、酒精、化学药物等引起慢性肝细胞损伤,导致细胞外基质(extracellular matrix, ECM)过度沉积,纤维结缔组织异常增生的一个病理过程。肝纤维化是肝炎发展为肝硬化、肝癌的必经阶段,因此预防、治疗甚至逆转肝纤维化成为慢性肝病研究的重点。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)与肝纤维化的形成密切相关,当肝脏受到损伤刺激时,静止状态的HSCs转化为激活状态的肌成纤维细胞样细胞(myofibroblast cells, MFCs),引起ECM合成及降解异常,导致肝脏结构和功能的改变。ECM的主要成份是胶原,在肝纤维化中主要以Ⅰ、Ⅲ型胶原明显增加为主。胶原代谢受到基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)及基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)的调节。因此HSCs的活化是肝纤维化形成的中心环节。肝纤维化的形成伴随着Raf-1/MEK/ERK1,2信号通路的激活,该通路的激活可以促进HSCs的增殖、分化和迁移。Raf激酶抑制蛋白(raf kinase inhibitor protein, RKIP)是磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族(phosphatid-ylethanolalmine binding proteins, PEBPs)中的成员,从植物到哺乳动物都有发现,可以调节多种信号通路的转导。RKIP与Raf-1激酶域相互作用,抑制Raf-1/MEK/ERK1,2信号通路的转导。而RKIP的过表达可以促进HSCs的迁移。Locostatin是一种无抗菌活性的黄恶唑酮衍生物,是RKIP特异性抑制剂。本论文应用四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)诱导小鼠肝纤维化形成,并通过腹腔注射Locostatin进行干预,旨在研究Locostatin对小鼠肝纤维化的影响及其作用机制。目的：CCl4诱导小鼠肝脏纤维化过程中,腹腔注射RKIP特异性抑制剂Locostatin进行干预,通过对肝脏炎症及纤维化指标的检测,研究Locostatin能否延缓肝纤维化的进展,甚至预防、阻止肝纤维化形成。方法：将27只小鼠随机分为正常对照组,模型组,治疗组。治疗组在CCl4诱导小鼠肝纤维化模型过程中,通过腹腔注射Locostatin进行干预。通过检测血清中谷氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST)的水平及肝脏组织HE染色来研究肝脏炎症程度的变化,通过血清羟脯氨酸(hydroxyproline, HYP)及肝脏组织Masson、苦味酸-天狼星红染色研究胶原的变化。通过实时定量聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative PCR, RT-qRCR)分析I型胶原、III型胶原、IV型胶原、MMP-13、MMP-2、 TIMP-1、TIMP-2、RKIP及α-SMA基因水平的表达。通过免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)及western blot方法分析I型胶原、III型胶原、IV型胶原、α-SMA及RKIP蛋白的表达。运用酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定MMP-13、MMP-2、TIMP-1及TIMP-2蛋白的表达量。结果：1 Locostatin可以抑制炎症反应,减少HSCs活化及胶原沉积：在HE染色中模型组炎症重于治疗组,正常对照组无炎症反应。在Masson染色及苦味酸-天狼星红染色中模型组胶原含量多于治疗组,正常对照组未见胶原在异常部位的沉积。IHC中模型组I、III型胶原及α-SMA的表达多于治疗组,正常对照组表达最少。IV型胶原在模型组表达量最低,治疗组表达量最高。模型组ALT(189.43±64.25)水平明显高于(P0.01)正常对照组(8.06±4.46)及治疗组(61.88±5.40)水平,正常对照组与治疗组无显著性差异(P0.05)。模型组AST(231.15±39.86)水平明显高于(P0.01)正常对照组(39.46±23.11)及治疗组(84.61±29.36)水平,正常对照组与治疗组无显著性差异(P0.05)。模型组HYP(3.07±0.47)水平明显高于(P0.01)正常对照组(1.63±0.78)及治疗组(2.06±0.83)水平,正常对照组与治疗组无显著性差异(P0.05)。2 Locostatin可以降低I型胶原、III型胶原及α-SMA mRNA的表达量,增加IV型胶原及RKIP mRNA的表达量。2.1 Locostatin可以降低I型及III型胶原mRNA的表达量：治疗组I型胶原mRNA的相对表达量(3.60±0.31)较模型组(9.51±1.37)显著降低(P0.01)。治疗组III型胶原mRNA的相对表达量(1.25±0.22)较模型组(3.23±0.43)显著降低(P0.01)。2.2模型组中IV型胶原mRNA表达量减少,Locostatin可以增加IV型胶原mRNA表达量：模型组IV型胶原mRNA的相对表达量(0.71±0.21)较治疗组(4.80±1.22)显著降低(P0.01)。2.3模型组TIMP-1、MMP-13、TIMP-2、MMP-2 mRNA的相对表达量(0.84±0.14,0.91±0.02,0.45±0.05,0.73±0.25)较治疗组(0.79±0.13,0.60±0.22,0.49±0.18,0.58±0.16)无明显差异(P0.05)。2.4 Locostatin可以降低α-SMA mRNA表达量：模型组α-SMA mRNA相对表达量(6.73±0.10)较治疗组(2.71±0.31)显著升高(P0.01)。2.5 Locostatin可以增加RKIP mRNA的表达量：治疗组RKIP mRNA的相对表达量(3.49±0.50)较模型组(1.06±0.16)显著升高(P0.01)。3 Locostatin可以降低Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、α-SMA蛋白表达量,增加Ⅳ型胶原、RKIP蛋白表达量。3.1模型组中Ⅰ型胶原蛋白表达升高,Locostatin可以降低Ⅰ型胶原蛋白表达：治疗组(0.68±0.06)较正常对照组(0.22±0.04)Ⅰ型胶原蛋白的表达量显著增高(P0.01),治疗组I型胶原蛋白表达量较模型组(1.37±0.13)明显降低(P0.01)。3.2模型组中Ⅲ型胶原蛋白表达升高,Locostatin可以降低Ⅲ型胶原蛋白表达：治疗组(0.16±0.02)较正常对照组(0.11±0.02)Ⅲ型胶原蛋白的表达量显著增高(P0.01),治疗组Ⅲ型胶原蛋白表达量较模型组(0.26±0.07)明显降低(P0.01)。3.3模型组中Ⅳ型胶原蛋白表达量最低,而Locostatin可以增加Ⅳ型胶原蛋白表达：模型组Ⅳ型胶原蛋白相对表达量(0.21±0.04)较正常对照组(0.38±0.07)及治疗组(0.68±0.04)均显著降低(P0.01),正常对照组蛋白相对表达量较治疗组显著降低(P0.01)。3.4模型组中α-SMA蛋白表达增加,Locostatin干预可以减少HSCs的活化,降低α-SMA蛋白的表达：模型组α-SMA蛋白相对表达量(1.54±0.13)比正常对照组(0.42±0.04)及治疗组(0.63±0.06)显著升高(P0.01),治疗组α-SMA蛋白表达量比正常对照组明显升高(P0.05)。3.5 CCl4造模不会影响RKIP的表达,但Locostatin干预可以反应性的引起RKIP表达量升高：治疗组RKIP蛋白的相对表达量(0.82±0.12)较模型组(0.46±0.09)均显著增高(P0.01),正常对照组(0.29±0.05)及模型组RKIP蛋白的相对表达量无明显差异(P0.05)。4 Locostatin通过调节MMP-13及TIMP-1的比值,促进Ⅰ型及Ⅲ型胶原降解。4.1 CCl4造模可以降低TIMP-1蛋白的表达,Locostatin干预对TIMP-1蛋白含量影响不大：模型组(136.88±39.51)及治疗组(140.39±24.70)TIMP-1的表达量比正常对照组(244.29±74.25)显著降低(P0.05),模型组及治疗组TIMP-1的表达无明显差异(P0.05)。4.2.模型组中MMP-13蛋白的表达降低,Locostatin干预对MMP-13蛋白含量影响不大：模型组(23.04±4.05)及治疗组(20.44±5.35)MMP-13的表达比正常对照组(31.96±8.28)明显降低(P0.05),模型组及治疗组MMP-13的表达无明显差异(P0.05)。4.3模型组中TIMP-2蛋白的表达降低,Locostatin干预对TIMP-2蛋白含量影响不大：模型组(8.72±5.17)及治疗组(9.42±3.01)TIMP-2的表达量比正常对照组(18.07±7.18)明显降低(P0.05),模型组及治疗组TIMP-2的表达无明显差异(P0.05)。4.4模型组中MMP-2蛋白的表达降低,Locostatin干预对MMP-2蛋白含量影响不大：模型组(326.42±64.63)及治疗组(342.54±66.73)MMP-2的表达量比正常对照组(700.99±245.48)显著降低(P0.01),模型组及治疗组MMP-2的表达无明显差异(P0.05)。4.5 Locostatin可以促进胶原降解：模型组(0.17±0.02)及治疗组(0.19±0.01)MMP-13/TIMP-1比值较正常对照组(0.13±0.02)显著升高(P0.01),模型组MMP-13/TIMP-1比值比治疗组显著降低(P0.01)。4.6正常对照组(0.40±0.07)、模型组(0.39±0.02)及治疗组(0.43±0.03)三组MMP-2/TMP-2相比,无明显差异(P0.05)。结论:Locostatin可以降低CCl4诱导的肝纤维化小鼠的肝脏炎症程度,这可能是通过Locostatin抑制炎症细胞迁移实现的。其次,Locostatin通过抑制肝星状细胞活化并增加MMP-13与TIMP-1比值,减少了Ⅰ型及Ⅲ型胶原沉积,延缓了肝纤维化进展。
【关键词】：Locostatin 肝纤维化 小鼠 肝星状细胞 RKIP 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶抑制剂
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文缩写13-14
• 前言14-15
• 材料与方法15-30
• 结果30-36
• 附图36-45
• 附表45-47
• 讨论47-50
• 结论50-51
• 参考文献51-53
• 综述 肝纤维化动物模型的制备及药物干预方式的选择53-62
• 参考文献58-62
• 致谢62-63
• 个人简历63

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  本文关键词：Locostatin对肝纤维化小鼠肝脏胶原代谢的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：333106