可促进rAAV在人肝星状细胞LX-2中基因表达的miRNA筛选及机制初探

发布时间：2021-08-13 12:44

　　肝纤维化是继发于肝脏炎症或损伤后组织修复的代偿反应。肝星状细胞的活化造成肝脏细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度沉积是导致肝纤维化的中心环节。若得不到及时治疗，肝纤维化会向肝硬化甚至肝癌发展。而近年来，基因治疗以其靶向性高，给药剂量低等优势逐渐成为药物开发的新方向。开发抗肝纤维化基因药物也成为治疗肝纤维化的研究热点。基于腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）开发的基因治疗载体——重组腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体，被认为是最有前景的基因治疗载体之一，并在临床实验中取得了一定的成绩。但其体内基因表达效率太低是限制rAAV载体临床应用的关键问题之一。而高剂量的rAAV基因药物会引发机体免疫反应。因此，rAAV基因药物研究的当务之急之一是提高其基因表达效率。基于此，本论文设想寻找一种能够进一步提高rAAV载体转染纤维化肝脏的有效手段来提高肝纤维化治疗的有效性。通过查阅相关文献发现，RNAi极有可能是一种有效手段。本论文选用在肝纤维化过程中发挥关键性作用的肝星状细胞（L... 

【文章来源】：华侨大学福建省

【文章页数】：138 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
第1章 引言
    1.1 基因治疗
        1.1.1 基因载体
        1.1.2 基因治疗研究现状
        1.1.3 基因治疗的应用障碍及应对策略
    1.2 肝纤维化与基因治疗
        1.2.1 肝纤维化概述
        1.2.2 抗肝纤维化治疗现状
    1.3 rAAV 与基因治疗
        1.3.1 AAV 与 rAAV 载体
        1.3.2 rAAV 载体的转染过程
        1.3.3 rAAV 基因药物的临床应用
        1.3.4 rAAV 基因药物存在的问题
        1.3.5 rAAV 载体表达效率优化策略
    1.4 RNAi 与基因治疗
        1.4.1 RNAi 与 miRNA
        1.4.2 miRNA 与病毒感染
    1.5 本课题的研究思路和论文结构安排
第2章 促进 rAAV 表达效率的 miRNA 的筛选
    2.1 实验材料、试剂与仪器
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 实验试剂与耗材
        2.1.3 主要实验仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 主要溶液的配制
        2.2.2 细胞复苏、冻存、培养与传代
        2.2.3 转染 miRNA
        2.2.4 rAAV 病毒转染
        2.2.5 rAAV2‐Gluc 荧光检测
        2.2.6 rAAV2‐EGFP 荧光检测
        2.2.7 MTT 法检测细胞存活率
    2.3 实验结果及分析
        2.3.1 促进 rAAV 载体表达的 miRNA 的筛选
        2.3.2 对明星 miRNA 序列进行再次筛选
    2.4 讨论与小结
第3章 影响 rAAV 表达的细胞信号通路预测与分析
    3.1 实验材料、试剂与仪器
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验试剂与耗材
        3.1.3 主要实验仪器
    3.2 实验方法
        3.2.1 miRNA 靶基因的预测
        3.2.2 基因富集分析
        3.2.3 信号通路分析
        3.2.4 主要溶液的配制
        3.2.5 细胞复苏、冻存、培养与传代
        3.2.6 转染 miRNA
        3.2.7 Trizol 法提取细胞总 RNA
        3.2.8 琼脂糖电泳鉴定细胞总 RNA
        3.2.9 实时荧光定量 PCR 分析（qReal‐time PCR）
    3.3 实验结果
        3.3.1 miRNA 靶基因预测及信号通路预测
        3.3.2 基因富集分析
        3.3.3 琼脂糖电泳鉴定细胞总 RNA
        3.3.4 实时荧光定量 PCR 分析（qReal‐time PCR）
    3.4 讨论与小结
第4章 总结与展望
    4.1 总结
    4.2 展望
创新点
参考文献
致谢
附录 A 初筛 miRNA 文库的实验结果
附录 B 备选 miRNA 预测靶基因 GO 分类的层次网络
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]MicroRNAs in the regulation of immune response against infections[J]. Yue ZHANG 1,Ying-ke LI 2(1 Department of General Surgery,East Hospital,Tongji University School of Medicine,Shanghai 200120,China)(2 Department of Anesthesiology,Changzheng Hospital,the Second Military Medical University,Shanghai 200003,China).  Journal of Zhejiang University-Science B（Biomedicine & Biotechnology）. 2013(01)
[2]人肝星状细胞激活和抑制及其相关分子机制的研究进展[J]. 秦棪楠,钟耀刚,李铮.  中国细胞生物学学报. 2011(10)
[3]PDGF及TGF信号转导通路与肝星状细胞活化增殖的研究进展[J]. 王慧,陈真.  安徽医药. 2011(07)
[4]Colchicine reduces procollagen Ⅲ and increases pseudocholinesterase in chronic liver disease[J]. Sergio Muntoni,Marcos Rojkind,Sandro Muntoni.  World Journal of Gastroenterology. 2010(23)
[5]miRNA调控病毒与宿主细胞相互作用的研究进展[J]. 张传军,连海.  中国生物制品学杂志. 2010(05)
[6]腺相关病毒基因治疗载体的改良与应用[J]. 张凤兰,文朝阳,丁卫.  首都医科大学学报. 2009(04)
[7]重组腺相关病毒载体在基因治疗中的应用[J]. 董晓宇,井申荣.  中国生物制品学杂志. 2009(07)
[8]自身互补型腺相关病毒载体发展趋势[J]. 吕颖慧,王启钊,肖卫东,刁勇,许瑞安.  生物工程学报. 2009(05)
[9]腺相关病毒外壳修饰与肿瘤靶向治疗[J]. 徐增辉,周秀梅,石文芳,钱其军.  科学通报. 2008(21)
[10]基因治疗病毒载体的研究进展[J]. 王振发,王烈,卫立辛.  医学综述. 2007(07)



本文编号：3340451