铁过负荷对miR-122表达的影响及其在肝脏炎症发生过程中的作用

发布时间：2017-04-30 02:13

  本文关键词：铁过负荷对miR-122表达的影响及其在肝脏炎症发生过程中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景铁是人体必需的微量营养素,参与多种生理生化过程,但是铁过负荷会对机体产生危害。因此,铁代谢受到机体的严格调控。肝脏是调控铁稳态的重要器官。但是有许多疾病(诸如酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝、糖尿病、血色素沉着病和地中海贫血等)的患者中存在不同程度的肝铁沉积,同时还存在轻至中度炎症。近期有研究发现,铁代谢的紊乱与多脏器衰竭和慢性肝衰竭急性发作的早期死亡率有关。有研究者提出铁过负荷可能与炎症有关。尽管肝铁过负荷对机体的危害一直受到相关领域研究者高度重视,但是,迄今为止肝铁负荷与炎症之间的联系并没有完全阐明。miRNA-122是肝脏特异性表达的miRNA,其表达变化在肝脏炎症的发生以及肝脏肿瘤的发生发展过程中具有重要作用。近年的研究发现,miRNA-122通过下调铁调素(Hepcidin)的表达参与机体铁稳态的调控。然而,miR-122的表达异常和铁过负荷之间是否存在联系,尤其是铁过负荷是否通过miR-122引起或加重炎症反应,未见报道。因此,本课题就铁过负荷对miR-122表达的影响及其在肝脏炎症反应中的作用进行了探索。研究目的通过动物实验和细胞实验,了解铁过负荷与肝脏组织细胞炎症的联系,明确miR-122的表达下降在铁过负荷引起的肝脏炎症发生过程中的作用,并在此基础上探讨铁过负荷miR-122表达下降的分子机制,为铁过负荷肝脏炎症的预防和治疗方法提供新的线索。研究方法1.实验动物小鼠分组及造模方法1.1纯化饲料组：四周龄雄性C57小鼠(购自上海斯莱克公司,体重(13±2)g。按体重随机分为1周组、2周组和4周组,自由进食(购自Research Diets公司的AIN-93去铁小鼠配方饲料,铁含量为3ppm)饮水,在12h/12h昼夜节律,22±2℃环境中饲养3天后,每组进一步分为铁缺乏组、铁过负荷组和适铁组(对照组)。铁缺乏组腹腔注射等体积的生理盐水,每周2次；适铁组每周2次腹腔注射2mg/ml右旋糖酐铁,每次注射剂量为20mg/kg小鼠体重(每只小鼠1周注射铁总量为0.6mg,2周为1.2 mg,4周为2.4mg,相当与小鼠相同时间内进食全价饲料中的铁摄入量；铁过负荷组每周腹腔注射2次20mg/ml右旋糖酐铁,每次注射剂量为200mg/kg小鼠体重(每只小鼠1周注射铁总量为6mmg,2周为12mg,4周为24mg)。1.2全价饲料组：小鼠来源、性别、体重、饲养环境同纯化饲料组,自由进食(购自我校实验动物中心的全价小鼠饲料,铁含量为200mg/kg)饮水,按体重随机分为1周组、2周组和4周组,每组进一步分对照组和铁过负荷组。对照组每周2次腹腔注射等体积的生理盐水；铁过负荷组每周2次腹腔注射20mg/ml右旋糖酐铁,每次注射剂量为200mg/kg小鼠体重。1.3右旋糖酐铁溶液配制：20ml/mg右旋糖苷铁溶液由100mg/ml右旋糖酐铁稀释5倍得到(100ml/mg右旋糖苷铁：生理盐水=1ml:4ml,充分混匀；2ml/mg右旋糖酐铁由20ml/mg右旋糖苷铁稀释10倍得到(20ml/mg右旋糖苷铁：生理盐水=1ml:9ml,充分混匀)。2.基因表达谱芯片采用基因表达谱芯片(Affymetrix GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array),对铁缺乏组,铁过负荷组和对照组C57小鼠(每组5只)进行mRNA表达谱检测,利用随机方差模型(RVM)进行差异基因筛选,分析工具为MultiClassDif。3.肝脏组织普鲁士蓝染色,HE染色及炎症病理评分肝脏样本固定在4%的多聚甲醛,包埋石蜡,然后切片(4μm),用苏木精和伊红染色,普鲁士蓝染色,荧光显微镜观察并采集图像。4.实时定量荧光PCR用Trizol提取肝脏组织或细胞的总RNA,测定其浓度,再用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA; miRNA采用特殊的miRNA茎环RT引物(购自广州锐博公司),将miRNA反转录成cDNA。以cDNA为模板,与引物,SYBR green,水混匀后,在StepOne PlusRT-PCR仪上进行扩增。根据RQ值,动物以18S(细胞以β-actin, miRNA以U6)为内参照,标准化后进行统计分析。5. Western-blot用凯基全蛋白试剂盒提取肝脏组织或细胞的总蛋白,测定浓度,变性,然后SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,封闭,孵育一抗：CCL2抗体(1：400)、p65抗体(1：1000)、IκBα抗体(1:1000)、p-IκBα抗体(1:1000)、TNFα (1:1000)、内参照抗体(β-actin抗体,1：3000),漂洗后,孵育二抗,漂洗后,显像,条带采用quantity one图像分析系统进行灰度分析。6.肝脏组织免疫荧光小鼠石蜡切片脱蜡,经抗原修复后,加一抗(CD68, TNFα, IL-1β),二抗(含FITC呈现明亮的黄绿色荧光),再用DAPI(发蓝光)复染细胞核,用抗荧光淬灭封片剂封片,共聚焦荧光显微镜观察并采集图像。7.细胞的培养及转染人肝癌细胞株Huh7细胞,人星状细胞LX-2细胞均在含10%胎牛血清,1%双抗(青链霉素混合液)的高糖DMEM中培养。THP-1细胞在含10%胎牛血清,1%双抗的1640中培养,用PMA(100nM)诱导为巨噬细胞。分别加入Holo-Tf(饱和铁的转铁蛋白)及FeSO4对细胞进行培养(5% CO2,37℃)。Huh7细胞接种培养板,当融合度为80%时,按说明书进行转染,将miR-122mimics (miR-122 inhibitor或干扰小RNA)以及转染试剂lipofctamine RNAiMAX分别用DMEM(或1640)稀释后混匀,37℃孵育15-20分钟。每孔预先加入含血清不含抗生素的培养基,再加入混合液。6-8h后换液,培养至48h收集细胞检测。质粒用DNA转染试剂进行转染,步骤同前。8. rAAV8病毒的制备(Package)按试剂盒说明书进行pAAVsc-CB6-PI Guassia和pAAVsc-CB6-PI-pri-mir-122 Guassia质粒的抽提,送生工公司进行测序鉴定。当HEK293细胞融合度为80-90%时,并按步骤进行质粒的细胞转染。收集细胞,并纯化rAAV8病毒,用实时定量荧光PCR法测定病毒的滴度。对2周铁过负荷小鼠尾静脉注射rAAV8-CB-PI Guassia对照病毒和rAAV8-CB-PI-pri-mir-122 Guassia病毒,注射量为1×1011vgs/只,于第4周处死老鼠,取小鼠血清、肝脏、脾、胰、肺、肾脏和脑组织备用。9. Gussia荧光的检测采集的小鼠血清用PBS稀释200倍,提取肝脏、脾、胰、肺、肾脏和脑组织总蛋白,按照Gaussia荧光素酶检测试剂盒说明书进行检测。10.双荧光素酶报告基因将野生型CCL2的3’-UTR区域,以及结合位点突变的序列克隆到p-MIR荧光素酶报告质粒中,并与miR-122mimics共同转染Huh7细胞,48h后检测荧光素酶和海肾荧光素酶的活性。11.染色质免疫共沉淀法(ChIP)Huh7细胞接种于6cm2培养皿中,分为对照组和Holo-Tf组,培养24h,按照Millipore公司染色质免疫共沉淀说明书的步骤进行试验。12.数据的统计与分析Western条带采用quantity one图像分析系统进行灰度分析,实验数据用(X±S)表示,使用统计软件SPSS18.0进行数据统计分析,采用两独立样本t检验和单因素方差分析(one-way ANVOA)进行各组之间的比较,各组间两两比较采用SNK-q检验。结果以P0.05为显著性水平,P0.01为非常显著性水平。结果1.铁过负荷可以引起肝脏组织细胞炎症反应1.1动物实验1.1.1基因芯片结果铁过负荷2周组小鼠,提取肝脏RNA,进行基因芯片检测,筛选出3282个差异基因,其中铁调素(Hamp),铁蛋白轻链(Ft11),骨形态蛋白6(Bmp6)显著升高,而转铁蛋白受体(Trfc)显著降低,多种炎症相关分子CD68, CD36, CCL2, CCL3, CCR2, IL-6, TNF等均显著升高。采用RT-PCR验证Hamp, Ftll, Trfc, CCL2, TNFamRNA结果与芯片结果一致。1.1.2铁过负荷1～4周组小鼠机体铁状况不论纯化饲料组还是全价饲料组,与各自对照组相比,铁过负荷组1-4周组小鼠随着铁负荷程度加重以及时间延长,其血清铁、转铁蛋白饱和度(TS%)、总铁结合力(TIBC),肝脏铁水平均逐渐升高。普鲁士蓝染色显示小鼠肝脏可见铁颗粒沉积逐渐加重。1.1.3铁过负荷1～4周组小鼠肝脏炎症相关分子mRNA及蛋白表达水平变化不论纯化饲料组还是全价饲料组,RT-PCR结果显示,与各自对照组相比,铁过负荷1-4周组小鼠肝脏CCL2, p65, TNFα, IL-6, IL-1βmRNA随铁过负荷程度的加重而显著升高。Western blot结果显示纯化饲料组,与各自对照组相比,铁过负荷1-4周组小鼠肝脏CCL2, p65, IκBα, p-IκBa蛋白随铁过负荷程度的加重而显著升高。免疫荧光结果显示纯化饲料组铁过负荷1-4周组小鼠肝脏CD68, TNFα, IL-0β绿色荧光明显增强。1.1.4铁过负荷1～4周组小鼠HE染色及炎症病理评分不论纯化饲料组还是全价饲料组,与各自对照组相比,铁过负荷1-4周组小鼠肝脏HE染色结果显示随着铁负荷程度增加小鼠肝脏的炎性细胞逐渐增多,炎症评分也逐渐升高。1.1.5铁过负荷1～4周组小鼠血清肝酶(AST, ALT)的变化不论纯化饲料组还是全价饲料组,与各自对照组相比,铁过负荷1周组小鼠血清谷丙转氨酶(ALT),天冬氨酸转氨酶(AST)水平没有明显改变,而铁过负荷2周组和4周血清转氨酶的水平明显增加。1.2细胞实验采用Huh7细胞,THP-1诱导的巨噬细胞,LX-2细胞(人星状细胞)进行细胞实验。1.2.1不同浓度Holo-Tf和FeSO4对细胞活性的影响采用流式细胞技术检测培养液中加入Holo-Tf(终浓度30μM),及不同浓度的硫酸亚铁培养后细胞的活性,结果显示与对照组没有明显差异。1.2.2在终浓度为30μMHolo-Tf和终浓度为100μM FeSO4的细胞培养液培养24h对细胞铁含量的影响采用PGSK (phen Green SK)二价铁荧光染料的方法比较暴露前后细胞内铁含量的变化,结果显示,在终浓度30μM Holo-Tf及终浓度100μM FeSO4培养24h,细胞内荧光强度明显减弱,表明细胞内铁含量明显增加。1.2.3在终浓度为30μMHolo-Tf的细胞培养液培养24h对Huh7细胞,THP-1诱导的巨噬细胞,LX-2细胞炎症相关分子mRNA及蛋白表达水平变化在培养液中加入Holo-Tf(终浓度30μM)培养Huh7细胞,THP-1诱导的巨噬细胞,LX-2细胞24h, RT-PCR结果显示CCL2, p65, TNFα, IL-6, IL-1βmRNA表达明显升高。Western blot结果显示Huh7细胞CCL2, p65,IκBα, p-IκBα, TNFα的蛋白表达明显升高。在培养液中加入FeSO4(终浓度100μM)培养Huh7细胞0,4,8,12,24,36h,CCL2mRNA及蛋白,p65, TNFα, IL-6mRNA表达逐渐增加。2.miR-122表达明显下降是铁过负荷引起肝脏组织细胞炎症反应的重要环节2.1动物实验2.1.1铁过负荷1～4周组小鼠肝脏组织中miR-122及pri-mir-122的表达变化不论纯化饲料组还是全价饲料组,与各自对照组相比,铁过负荷1-4周组小鼠肝脏组织中miR-122及pri-mir-122表达均显著降低。2.1.2过表达miR-122对铁过负荷小鼠肝脏炎症分子表达的影响构建了rAAV8-CB-PI Guassia(对照病毒)和rAAV8-CB-PI-pri-mir-122 Guassia病毒(高表达miR-122病毒),尾静脉注射,在实验第4周后处死动物取标本进行相关指标检测。与对照组相比,IO+rAAV8-122组(铁过负荷并注射rAAV8-CB-PI-pri-mir-122 Guassia病毒)的小鼠肝脏miR-122的表达水平明显升高,而IO及IO+rAAV8组(铁过负荷并打注射rAAV8-CB-PI Guassia病毒)的小鼠肝脏miR-122的表达水平明显降低(1)各组小鼠血清生化指标及肝铁含量变化与对照组相比,IO+rAAV8-122组的小鼠血清AST, ALT均恢复到正常水平。但是肝铁,血清铁,TIBC, TS%仍然显著升高。IO组及I0+rAAV8组的小鼠血清AST,ALT,肝铁,血清铁,TIBC, TS%显著升高。(2)各组小鼠肝脏组织中的铁调控指标及相关炎症分子mRNA及蛋白表达水平变化RT-PCR结果显示,与对照组相比,10, IO+rAAV8组及IO+rAAV8-122组小鼠肝脏Hamp.Ftl1mRNA表达水平明显升高,Trfc mRNA表达明显降低。IO+rAAV8-122组的小鼠肝脏CCL2, p65, TNF-α, IL-1β, IL-6 mRNA虽然较对照组高,但是与10,I0+rAAV8组相比,明显下降。Western blot结果显示IO+rAAV8-122组的小鼠肝脏CCL2, p65蛋白表达水平虽然较对照组高,但是与10, I0+rAAV8组相比,明显下降。免疫荧光检测结果显示IO+rAAV8-122组的小鼠肝脏TNF-α, IL-6, CD68的绿色荧光虽然较对照组高,但是与IO, I0+rAAV8组相比,可见到绿色荧光明显减少。10及I0+rAAV8组小鼠绿色荧光明显增多。2.2细胞实验2.2.1 Huh7、HepG2、THP-1诱导的巨噬细胞、LX-2细胞miR-122表达丰度的检测采用RT-PCR检测与Huh7细胞相比,HepG2细胞,THP-1诱导的巨噬细胞几乎不表达miR-122, miR-122的表达量是Huh7细胞的63%,而LX-2细胞是Huh7细胞的7.4%。因此实验选用Huh7细胞作为实验对象观察铁过负荷对miR-122表达的影响。2.2.2铁过负荷对Huh7细胞miR-122及pri-mir-122表达的影响在培养液中加入的Holo-Tf(终浓度30μM)培养Huh7细胞24h, miR-122及pri-mir-122表达水平明显下降。在培养液中加入FeSO4(终浓度为50,100,150,200μM)培养Huh7细胞,miR-122表达水平在100μM时开始明显下降,虽然随着添加浓度的增加miR-122表达水平下降幅度有所增加,但与100μM时的表达水平没有明显差异,因此,采用在培养液中加入FeSO4(终浓度100μM)培养Huh7细胞0,4,8,12,24,36h, Huh7细胞miR-122在8h开始明显下降,随时间延长,铁负荷程度的加重而逐渐降低,pre-mir-122及pri-mir-122表达水平在4h开始明显下降,随时间延长而进一步降低。2.2.3过表达miR-122对细胞铁过负荷后炎症分子表达的影响为了解铁过负荷引起肝细胞miR-122表达下降与CCL2表达增加的关系,我们通过转染miR-122 mimics提高Huh7细胞miR-122表达水平,通过转染miR-122 inhibitor抑制Huh7细胞表达miR-122,结果显示,提高miR-122表达水平可以抑制CCL2表达,而抑制miR-122表达则可以促进CCL2表达。通过生物信息学分析,发现小鼠及人的CCL2在3'-UTR区与miR-122有结合位点。我们采用双荧光报告基因检测,结果表明miR-122与人CCL2的3'-UTR区的结合位点有活性。为进一步观察miR-122对细胞铁过负荷后炎症分子表达的变化,将Huh7细胞细胞分为4组：对照组(Control),铁过负荷组(Holo-Tf), miR-122 mimics组和铁过负荷加miR-122 mimics组(Holo-Tf+miR-122 mimics),采用Western blot观察4组细胞CCL2, p65, IκBα, p-IκBα, TNFa蛋白的表达变化,结果显示,虽然与对照组相比,上述蛋白仍然升高,但是与铁过负荷组相比明显降低。HepG2细胞几乎不表达miR-122,我们采用转染miR-122mimics和转染pAAVsc-CB-PI-pri-mir-122 Guassia质粒等方法使HepG2细胞高表达miR-122,然后观察铁过负荷HepG2细胞CCL2, p65, IκBα, p-IκBα, TNFa蛋白表达的变化。Western blot结果显示虽然与对照组相比,上述蛋白仍然升高,但与铁过负荷组相比明显降低。3.HNF4α表达下降是铁过负荷下调肝组织细胞miR-122的关键因素之一3.1铁过负荷对Huh7细胞HNF1α、HNF4α、HNF3β、HNF6、C/EBPa等转录因子mRNA表达的影响通过查阅文献,发现调控miR-122的转录因子有HNF1α、uHNF4α、HNF3β、HNF6、 C/EBPa等。因此,我们进行了转录因子的检测。在培养液中加入Holo-Tf (终浓度30μM)培养Huh7细胞24h,荧光定量PCR结果显示与对照组相比,在HNF1α、HNF4α、HNF3β、HNF6、C/EBPa转录因子中,只有HNF4amRNA表达下降,而其余转录因子的表达均无明显差异。3.2铁过负荷对肝组织细胞转录因子HNF4a表达的影响动物实验荧光定量PCR及Western blot结果显示,与同期对照组相比,1～4周铁过负荷时小鼠肝脏HNF4αmRNA和蛋白表达水平均明显下降。细胞实验,在培养液中加入Holo-Tf(终浓度30μM)培养Huh7细胞24h.Western blot结果显示HNF4a蛋白表达水平明显下降。在培养液中加入FeSO4(浓度100μM)培养Huh7细胞0,4,8,12,24,36h, Huh7细胞HNF4amRNA和蛋白表达水平在4h开始明显下降,随时间延长而逐渐降低。3.3转录因子HNF4a对miR-122表达的影响我们采用HNF4a siRNA干扰和转染HNF4a质粒的方法,使Huh7细胞抑制或过表达转录因子HNF4a,观察miR-122的表达变化。实时荧光定量PCR结果显示,HNF4a siRNA干扰的Huh7细胞,HNF4a mRNA及蛋白表达水平明显下降,此时pri-mir-122及miR-122表达明显降低,而CCL2表达明显升高；转染过表达HNF4a质粒细胞HNF4αmRNA及蛋白表达水平明显升高,pri-mir-122及miR-122表达明显升高,CCL2表达明显降低。3.4铁过负荷对肝细胞HNF4a与miR-122启动子区结合活性的影响为证实铁过负荷是否是通过HNF4a直接调控miR-122,我们在培养液中加入Holo-Tf(终浓度30μM)培养Huh7细胞24h,染色质免疫共沉淀法(ChIP)结果显示,HNF4a与miR-122启动子区有结合活性,但铁过负荷可以引起HNF4a与miR-122启动子区结合活性减弱。结论本课题通过动物实验和细胞实验发现：一、铁过负荷可以导致实验动物肝脏炎症相关分子CCL2, p65, TNFα, IL-6, IL-1βmRNA及蛋白显著升高,炎症病理评分和血清ALT、AST逐渐升高；二、铁过负荷可以导致Huh7细胞,THP-1诱导的巨噬细胞,LX-2细胞CCL2, p65, TNFα, IL-6, IL-1βmRNA表达明显升高；三、铁过负荷可引起肝脏组织细胞miR-122表达下降,使其下游靶基因趋化因子CCL2的表达增强,NF-κB信号通路活性增强,TNFα, IL-6, IL-1β表达明显增加。提高miR-122的表达可明显缓解铁过负荷引起的上述炎症反应；四、铁过负荷可引起肝脏组织细胞HNF4a mRNA和蛋白的表达下调,ChIP证实,铁过负荷可以减弱HNF4α与miR-122启动子序列的结合活性,而过表达HNF4α可以明显缓解铁过负荷引起的miR-122、CCL2表达变化,抑制HNF4α表达可以明显加重铁过负荷引起的miR-122、CCL2表达变化；综合上述实验结果,表明,铁过负荷可通过抑制HNF4α的表达,使得miR-122的表达下降,进而上调CCL2的表达,激活NF-κB信号通路,引起肝脏组织细胞的炎症反应；而上调miR-122的表达可能是缓解铁负荷引起炎症反应的有效方法。
【关键词】：铁过负荷 炎症 miR-122 趋化因子CCL2 rAAV8 HNF4α
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 摘要5-13
• Abstract13-21
• 中英文缩略词表21-22
• 前言22-25
• 参考文献23-25
• 第一部分 铁过负荷可以引起肝脏组织细胞炎症反应25-54
• 一、材料与方法25-40
• 二、结果40-51
• 三、讨论51-53
• 参考文献53-54
• 第二部分 miR-122表达明显下降是铁过负荷引起肝脏组织细胞炎症反应的重要环节54-83
• 一、材料与方法54-68
• 二、结果68-80
• 三、讨论80-81
• 参考文献81-83
• 第三部分 HNF4α表达下降是铁过负荷下调肝组织细胞miR-122的关键因素之一83-97
• 一、材料与方法83-89
• 二、结果89-94
• 三、讨论94-95
• 参考文献95-97
• 全文总结97-98
• 综述98-104
• 参考文献101-104
• 附录104-106
• 在读期间发表的论文106-107
• 致谢107-108

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本文编号：336049