ADAM9在酒精性肝损伤过程中的功能研究

发布时间：2021-09-07 14:07

　　目的本课题使用CRISPR/Cas9技术靶向抑制小鼠ADAM9基因的表达,研究小鼠急性酒精性肝损伤过程中ADAM9基因的功能及其调控的分子机制。方法（1）在NCBI中搜索ADAM9相关的基因序列,并找出人鼠共有的ADAM9基因序列的外显子和内含子,在外显子中查找人鼠相同CRISPR序列设计位点处的基因序列,构建三个同时表达sgRNA、Puromycin和Cas9的三合一质粒。（2）将3个质粒以1:1:1的比例,加入小鼠成肌细胞培养皿中,并加入细胞转染剂,对细胞进行转染;继续培养转染细胞,待细胞浓度达到70%左右时,更换含有嘌呤霉素抗性的筛选培养基筛选耐药阳性细胞;待形成稳定的阳性克隆后,提取细胞DNA,进行测序比对,找出使细胞DNA产生突变的质粒。（3）购买健康清洁级昆明雄性小鼠36只,用普通饲料喂养一周待小鼠适应环境后,随机平均分为3组:正常组（Normal）12只,注射生理盐水酒精灌胃组（saline+alcohol）12只,注射质粒酒精灌胃组（ADAM9-sgRNA3+alcohol）12只。对照组小鼠不做任何处理,sgRNA组小鼠分别注入筛选出的活性质粒,模型组小鼠尾静脉注射等... 

【文章来源】：河南科技大学河南省

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 绪论
    1.1 酒精性肝损伤
        1.1.1 病理特点
        1.1.2 酒精性肝损伤动物模型
    1.2 酒精性肝损伤过程中分子调控机制研究
        1.2.1 CYP2E1与酒精性肝损伤
        1.2.2 应激分子与酒精性肝损伤
        1.2.3 TGF-βl与酒精性肝损伤
        1.2.4 肝细胞凋亡与酒精性肝损伤
    1.3 ADAM9介绍
    1.4 CRISPRCas9系统发现与分类
        1.4.1 CRISPR/Cas9系统的作用机理
        1.4.2 CRISPR/Cas9系统清除外源性DNA原理
        1.4.3 CRISPR/Cas9系统构建
        1.4.4 降低CRISPR/Cas技术基因编辑脱靶效率的研究
第2章 前言
第3章 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞和质粒
        3.1.2 实验动物
        3.1.3 实验仪器
        3.1.4 实验试剂及溶液配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 实验设计
        3.2.2 CRISPR/Cas9技术靶向突变小鼠Adam9基因三合一质粒构建
        3.2.3 细菌培养
        3.2.4 质粒提取
        3.2.5 细胞培养
        3.2.6 细胞转染
        3.2.7 最佳嘌呤酶素浓度
        3.2.8 嘌呤酶素筛选
        3.2.9 PCR技术检测
        3.2.10 小鼠尾静脉注射
        3.2.11 动物实验
        3.2.12 血清AST、ALT酶活性的检测
        3.2.13 蜡块包埋组织切片制作
        3.2.14 HE染色检测各组小鼠的肝脏损伤情况
        3.2.15 PAS法检测各组小鼠肝脏中糖原的表达情况
        3.2.16 Hoechst33258染色法检测各组小鼠的肝细胞凋亡情况
        3.2.17 免疫印迹检测蛋白的表达情况
    3.3 实验数据的统计学分析
第4章 结果
    4.1 CRISPR/Cas9技术靶向突变小鼠Adam9基因三合一质粒
    4.2 C2C12细胞培养和sgRNA活性验证
    4.3 小鼠血清ALT、AST酶活性的检测结果
    4.4 肝脏组织HE染色结果
    4.5 肝脏组织PAS染色结果
    4.6 肝脏组织Hoechst33258染色结果
    4.7 免疫印迹法检测组织蛋白的表达结果
第5章 讨论
    5.1 小鼠急性酒精性肝损伤中ADAM9与转氨酶和组织损伤的关系
    5.2 小鼠急性酒精性肝损伤中ADAM9和糖原储备的关系
    5.3 小鼠急性酒精性肝损伤中ADAM9和细胞凋亡的关系
    5.4 小鼠急性酒精性肝损伤中ADAM9对肝细胞应激分子HSP27、HSP70的影响
    5.5 小鼠急性酒精性肝损伤中ADAM9对肝细胞增殖的作用
    5.6 小鼠急性酒精性肝损伤中ADAM9和VEGF的关系
    5.7 小鼠急性酒精性肝损伤中ADAM9和IL-6信号途径的关系
    5.8 问题与展望
第6章 结论
参考文献
缩略语词汇表
附录Ⅰ 图及说明
致谢
攻读学位期间的研究成果


【参考文献】：
期刊论文
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[3]瑞舒伐他汀抑制NF-κB活化下调LPS诱导小胶质细胞TNF-α表达的实验研究[J]. 冯社军,王慧娟,李军涛,武艳强.  西部医学. 2014(11)
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本文编号：3389686