HBV相关肝病肝移植受体术后外周免疫细胞及骨髓造血干祖细胞HBV存在状态检测及临床意义分析

发布时间：2021-09-07 19:23

　　肝移植（liver transplantation，LT）是目前治疗终末期肝病（end stage liver disease，ESLD）的有效手段。在我国，乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）相关肝病已成为肝移植的主要适应症。但是肝移植术后，即使在使用拉米夫定（Lamivudine，LAM）和乙肝免疫球蛋白的情况下，仍有较高的HBV再感染率和乙肝（hepatitis B，HB）复发率，严重影响了肝移植的中远期效果。本课题从研究乙肝病毒相关肝病肝移植术后的免疫-造血系统乙肝病毒库入手，揭示肝移植术后HBV再感染/HB复发的可能机制。在第一部分，我们建立了一种灵敏可靠的检测HBV共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的实时荧光定量聚合酶链式反应方法，为后继的研究打下了基础。在第二部分，我们利用密度梯度离心和免疫磁珠分离法获得骨髓造血干祖细胞和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）、T细胞、B细胞和单核细胞（monocyte，MNC），分别检测总HBV DN... 

【文章来源】：四川大学四川省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：133 页

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英文摘要
前言
第一部分:酶辅助实时荧光定量PCR检测HBV共价闭合环状DNA方法的建立
    一.材料与方法
        1.试剂与材料、仪器
            1.1 试剂及配制
            1.2 材料
        2.实验步骤
            2.1 HBVcccDNA标准品的制备
                2.1.1 pBHB4质粒的扩增
                2.1.2 pBHB4质粒DNA的提取与纯化
            2.2 HBVrcDNA标准品的制备
            2.3 HBVcccDNA引物的设计、合成与选择
                2.3.1 引物设计与合成
                2.3.2 引物的验证
                    2.3.2.1 引物特异性验证
                    2.3.2.2 引物灵敏度验证
                    2.3.2.3 引物的选择
            2.4 HBVcccDNA实时荧光定量PCR检测方法(标准曲线)的建立
    二.实验结果
    三.讨论
    四.结论
第二部分:HBV相关终末期肝病肝移植受体术后外周免疫细胞与骨髓CD34+细胞总HBVDNA及HBVcccDNA检测与临床意义分析
    一.材料与方法
        1.病例选择
        2.试剂与材料、仪器
            2.1 试剂
            2.2 材料
            2.3 仪器
        3.实验步骤
            3.1 外周血及骨髓标本的采集
            3.2 外周血免疫活性细胞的分离
            3.3 骨髓造血干、祖细胞的分离
            3.4 DNA提取
            3.5 细胞内总HBVDNA检测
            3.6 细胞内HBVcccDNA检测
        4.统计方法
    二.实验结果
        1.常规检测结果
        2.每20ml样品所获细胞数
        3.血清HBV标志物及HBVDNA检测结果
        4.细胞内总HBVDNA检测结果
    三.讨论
        3.1 肝移植术后受体外周免疫细胞及骨髓CD_(34)~+细胞内HBVDNA存在的意义
        3.2 肝移植术后受体外周免疫细胞及骨髓CD_(34)~+细胞内HBV复制状态及其意义
    四.结论
第三部分:利用HBV-Alu-PCR检测HBV相关肝病肝移植受体术后外周血单个核细胞与骨髓造血干祖细胞(CD_(34)~+)HBVX基因整合状态
    一.材料与方法
        1.病例选择
        2.试剂与材料、仪器
            2.1 试剂
            2.2 材料
            2.3 仪器
        3.实验步骤
            3.1 外周血及骨髓标本采集
            3.2 PBMC与骨髓CD_(34)~+细胞分离获取
            3.3 PBMC与骨髓CD_(34)~+细胞DNA提取
            3.4 HepG2.2.15肝癌细胞株DNA提取
            3.5 HBV-Alu-PCR原理
            3.6 HBV-Alu-PCR检测HBVX基因整合
                3.6.1 引物设计与合成
                3.6.2 HBV-Alu-PCR反应步骤及条件
                3.6.3 结果判定及测序
                    3.6.3.1 终产物电泳
                    3.6.3.2 测序
    二.结果
    三.讨论
    四.结论
全文参考资料
综述:机体免疫系统功能与乙肝病毒负荷的关系
    一.HBV感染对免疫系统的影响
        1.HBV感染免疫细胞的机制与存在形式
        2.HBV感染对免疫细胞功能的影响
            2.1 对T细胞的影响
            2.2 HBV对B细胞的影响
            2.3 HBV对抗原提呈细胞的影响
            2.4 HBV对其他免疫活性细胞的影响
            2.5 HBV对细胞因子及其他免疫相关因子的影响
    二.机体免疫系统清除HBV的机制
        1.溶细胞的HBV清除机制
            1.1 抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)
            1.2 CTL作用
        2.非溶细胞的HBV清除机制
    三.HBV免疫逃逸机制
        1.HBV因素
            1.1 HBV基因整合
            1.2 HBV复制与转录水平的减弱
            1.3 HBV基因变异
            1.4 HBV的肝外分布
            1.5 HBV所致免疫耗竭
        2.机体因素
            2.1 免疫耐受
            2.2 遗传因素
    四.HBV对治疗的反应
        1.干扰素
        2.核苷类似物
        3.HBV疫苗
        4.肝移植术后体内HBV变化
    综述参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Mechanism of T cell hyporesponsiveness to HBcAg is associated with regulatory T cells in chronic hepatitis B[J]. Yasuteru Kondo,Koju Kobayashi,Yoshiyuki Ueno,Masaaki Shiina,Hirofumi Niitsuma,Noriatsu Kanno,Tomoo Kobayashi,Tooru Shimosegawa.  World Journal of Gastroenterology. 2006(27)
[2]多重PCR法检测外周血单个核细胞中的HBVDNA与HBVcccDNA[J]. 郭皓宇,谭德明,刘洪波.  中国医师杂志. 2005(04)
[3]PBMC中HBV cccDNA与HBV宫内感染关系的研究[J]. 冯永亮,王素萍,史晓红,王效军,李铁钢.  现代预防医学. 2005(03)
[4]肝癌中乙型肝炎病毒整合位点的分离鉴定[J]. 高海峰,屠红.  中华肝脏病杂志. 2004(09)



本文编号：3390115