基于CRISPR/Cas9技术研究Gp96在小鼠急性酒精性肝损伤中的作用

发布时间：2021-09-12 17:04

　　目的本课题在CRISPR/Cas9技术的支持下,通过基因编辑Gp96序列,抑制其基因表达,研究Gp96在急性酒精性肝损伤过程中的作用及调控的分子机制。方法（一）设计质粒:NCBI中检索Gp96相关基因序列,在外显子中查找人鼠相同的Gp96基因序列,根据二者的蛋白保守功能域位置,将靶向突变的目标序列（CRISPR）设计在外显子4⁹。将外显子4至外显子9进行序列比对,共发现6个相同的CRISPR序列位置,但经脱靶率分析后最终设计出3个CRISPR序列,并构建三种质粒。（二）有效sgRNA筛选及验证:将合成的三种质粒1:1:1混合转染小鼠成肌细胞C2C12,嘌呤酶素筛选转染成功的细胞,提取DNA进行PCR扩增、电泳、胶回收进行测序及有效sgRNA蛋白验证。（三）体外实验:培养小鼠成肌细胞C2C12,分为三组,Normal组:不做任何处理;Normal+alcohol组:直接给予酒精诱导培养;Gp96-sgRNA+alcohol组:将有效sgRNA进行稳定转染后给予酒精诱导培养。CCK-8细胞活性增殖检测;Hoechst33258细胞凋亡染色;免疫印迹检测相关因子表达:热... 

【文章来源】：河南科技大学河南省

【文章页数】：76 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 绪论
    1.1 酒精性肝损伤概述
        1.1.1 酒精性肝损伤的流行病学
        1.1.2 酒精性肝损伤的病理学特点
    1.2 酒精性肝损伤机制
        1.2.1 酒精及其代谢产物对肝脏的毒作用
        1.2.2 氧化应激与酒精性肝损伤
        1.2.3 细胞凋亡与酒精性肝损伤
    1.3 急性酒精性肝损伤模型的制备
    1.4 热休克蛋白Gp96
        1.4.1 热休克蛋白概述
        1.4.2 Gp96的分子结构
        1.4.3 GP96的功能和应用
    1.5 CRISPR/Cas9技术概述
        1.5.1 CRISPR/Cas9系统的发现
        1.5.2 CRISPR/Cas9系统的结构
        1.5.3 CRISPR/Cas9系统的作用机制
        1.5.4 CRISPR/Cas9系统应用现状
第2章 前言
第3章 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 细胞
        3.1.2 质粒
        3.1.3 实验动物
        3.1.4 主要仪器设备
        3.1.5 主要实验试剂
        3.1.6 主要溶液配制
    3.2 实验方法
        3.2.1 实验设计
        3.2.2 CRISPR/Cas9技术靶向突变小鼠Gp96基因三合一质粒构建
        3.2.3 细菌培养
        3.2.4 提取质粒
        3.2.5 细胞培养
        3.2.6 确定最佳嘌呤酶素浓度
        3.2.7 细胞转染
        3.2.8 嘌呤酶素筛选
        3.2.9 PCR技术检测
        3.2.10 胶回收DNA
    3.3 体外实验
        3.3.1 免疫印迹蛋白检测
        3.3.2 CCK-8细胞活性检测
        3.3.3 Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况
    3.4 体内实验
        3.4.1 血清AST、ALT酶活性的检测
        3.4.2 肝组织蜡块包埋及组织切片制作
        3.4.3 HE染色检测各组小鼠的肝脏损伤情况
        3.4.4 PAS法检测各组小鼠肝脏中糖原的表达情况
        3.4.5 Hoechst33258染色法检测小鼠的肝细胞凋亡情况
        3.4.6 免疫印迹蛋白检测
    3.5 实验数据的统计学分析
第4章 结果
    4.1 CRISPR/Cas9技术靶向突变小鼠GP96基因三合一质粒
        4.1.1 设计CRISPR序列
        4.1.2 YSY线性化三合一CRISPR/Cas9质粒构建
        4.1.3 转化子PCR验证
        4.1.4 转化子的测序验证
    4.2 细胞转染和sgRNA活性验证
        4.2.1 转染效率检测
        4.2.2 测序筛选sgRNA3为有效向导RNA
        4.2.3 免疫印记验证有效sgRNA3
    4.3 细胞活性检测结果
    4.4 细胞Hoechst33258染色结果
    4.5 免疫印迹法检测细胞蛋白表达结果
    4.6 小鼠血清ALT、AST酶活性的检测结果
    4.7 肝脏组织HE染色结果
    4.8 肝脏组织PAS染色结果
    4.9 肝脏组织Hoechst33258染色结果
    4.10 免疫印迹法检测组织蛋白的表达结果
第5章 讨论
    5.1 Gp96与酒精诱导的细胞毒性作用
    5.2 小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96与转氨酶和组织损伤的关系
    5.3 小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96和糖原储备的关系
    5.4 小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96和细胞凋亡的关系
    5.5 小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96对肝细胞应激分子HSP27、HSP70的影响
    5.6 小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96对肝细胞增殖的作用
    5.7 小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96和VEGF的关系
    5.8 小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96和p-STAT3信号途径的关系
    5.9 小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96和CYP2E1的关系
    5.10 小鼠急性酒精性肝损伤中Gp96和TNF-α的关系
    5.11 问题与展望
第6章 结论
参考文献
缩略语词汇表
附录Ⅰ 图及说明
致谢
攻读学位期间的研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]CD133表位联合热休克蛋白佐剂疫苗引发抗白血病的免疫应答（英文）[J]. 王硕,范红霞,李杨,郑华国,李鑫,李长菲,陈立钊,鞠莹,孟颂东.  生物工程学报. 2017(06)
[2]CYP2E1调控酒精性肝病发病机制的研究进展[J]. 陈丹,林秀贤,陈尧.  中国临床药理学与治疗学. 2017(02)
[3]柽柳对小鼠酒精性肝损伤的保护作用及机制[J]. 张钰,韩琛,王朝霞,王兆朋,张月英,周淑萍,马冉冉,王恒孝.  山东大学学报(医学版). 2017(02)
[4]CRISPR-Cas9研究及应用进展[J]. 李肃,吴楠,孙冬琳,金焰.  国际遗传学杂志. 2016 (06)
[5]热休克蛋白gp96 3′UTR作为ceRNA通过miR-642a调控DOHH的表达[J]. 盛春海,孙璐,初骁宇,李长菲,孟颂东.  生物化学与生物物理进展. 2016(10)
[6]肠道菌群与酒精性肝病[J]. 熊燕鹃,罗和生.  胃肠病学和肝病学杂志. 2016(09)
[7]对乙酰氨基酚诱导的小鼠急性肝损伤过程中IL-6跨信号途径对PCNA表达的影响[J]. 韩红梅,李三强,卢华杰,张勇勇,王秀秀,马曌.  胃肠病学和肝病学杂志. 2016(09)
[8]小鼠酒精性肝损伤过程中肝糖原的表达变化[J]. 尚付梅,李三强,卢华杰,姜雅坤,乔新杰,白淼水,霍续磊,李小苹,李思源,李英娇.  中国临床药理学杂志. 2016(09)
[9]酒精性肝损伤的基础医学研究进展[J]. 王东,张宏峰,王改琴,贾书花.  长治医学院学报. 2016(02)
[10]酒精性肝病流行病学及发病机制研究进展[J]. 高潇雪,刘立新.  中华消化病与影像杂志(电子版). 2016(02)



本文编号：3394609