内质网应激对巨噬细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）表达的调控及其分子机制研究

发布时间：2017-05-02 10:08

  本文关键词：内质网应激对巨噬细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）表达的调控及其分子机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：TRAIL(TNF-related apoptosis inducing-ligand)是继TNF、Fas L之后发现的肿瘤坏死家族中第三个凋亡分子,其与细胞膜上的TRAIL受体DR4/5结合从而发挥生物学作用。在免疫系统中,免疫细胞的凋亡是重要的免疫调节,是机体维持自身的稳定,避免自身免疫疾病的重要机制。很多研究报道,TRAIL在自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞,单核巨噬细胞和树突状细胞(DC)中表达,参与其对机体的免疫监视,可能在促进免疫细胞凋亡,调节免疫耐受等方面有重要作用。内质网(Endoplasmic reticulum,ER)是细胞蛋白质的合成和运输的重要调节器。对种种刺激相当敏锐,蛋白质折叠的需求增强或外界刺激等因素,均可引起ER蛋白折叠负荷和蛋白质折叠能力之间的不平衡,导致错误折叠蛋白或未折叠蛋白在ER腔内蓄积,从而引发内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。前期研究发现在肝纤维化的恢复过程中,肝脏巨噬细胞可通过表达TRAIL促进肝星状细胞的凋亡从而促进肝纤维化的恢复;ERS相关蛋白在肝纤维化病程中动态变化,ERS参与活化HSC凋亡的调控,其机制可能与其释放细胞内钙离子,导致细胞内钙离子升高,从而诱导Calpain/Caspase和JNK/p38 MAPK激活有关。TRAIL可能通过诱导活化HSC中内质网应激相关蛋白CHOP,GRP78,Caspase-12的表达,从而促进HSC的凋亡。ERS在肝纤维化的发病机制中可能起重要作用,然而ERS是否参与巨噬细胞TRAIL表达的调控,从而促进HSC凋亡,逆转肝纤维化尚未有研究。本课题以三种不同来源的巨噬细胞为研究对象,旨在探讨ERS对巨噬细胞TRAIL表达的调控及机制,从而进一步完善肝纤维化发病及逆转机制的研究。主要研究内容如下:1.ERS促进巨噬细胞表达TRAIL为了研究ERS对巨噬细胞中TRAIL表达的影响,分别给予给予不同的内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(Thapsigargin,TG)和衣霉素(tunicamycin,TM),体外诱导小鼠RAW264.7巨噬细胞株,THP-1细胞及原代小鼠腹腔巨噬细胞,采用RT-PCR法检测TRAIL的m RNA表达变化;免疫印迹观察细胞内TRAIL总蛋白的表达变化;ELISA方法检测可溶性TRAIL蛋白(s TRAIL)的表达变化;流式细胞仪检测ERS对膜结合型TRAIL蛋白表达的影响。结果发现,内质网应激的两种诱导剂均上调TRAIL m RNA水平表达和可溶性及总蛋白的表达,而对膜型TRAIL蛋白没有显著影响,提示ERS可能参与调控巨噬细胞TRAIL的表达。2.MAPK通路参与ERS诱导的巨噬细胞TRAIL的表达以RAW264.7细胞为研究对象,分别用1μM TG和1μg/ml TM刺激细胞0-24h,采用Western blot法检测MAPK各下游通路是否激活。结果发现,与对照组相比,ERS能显著诱导ERK,JNK和p38 MAPK蛋白的表达及激活,引起了细胞活化。再分别给予ERK抑制剂PD98059,JNK抑制剂SP600125及p38 MAPK抑制剂SB202190处理,采用RT-PCR方法检测TRAIL m RNA水平;Western blot方法检测TRAIL和ERK、JNK、p38 MAPK蛋白及磷酸化的程度。结果发现,与TG和TM模型组相比,JNK抑制剂SP600125同时显著下调了TRAIL m RNA及蛋白水平。提示JNK MAPK通路可能参与ERS诱导的巨噬细胞TRAIL的表达。为了进一步探讨JNK MAPK通路参与TRAIL表达的调控机制,分别用1μM TG和1μg/ml TM刺激细胞24h后,使用ELISA法,RT-q PCR法,Western blot法及双荧光素酶报告基因法检测JNK MAPK的下游转录因子AP-1(activator protein-1)的激活。结果显示,ERS可使AP-1磷酸化及激活。进一步给予AP-1抑制剂SR 1130及转染野生型TRAIL启动子荧光素酶,采用RT-PCR法,RT-q PCR法,Western Blot,ELISA,荧光素酶报告基因实验分别检测TRAIL m RNA,蛋白水平及荧光强度。结果显示与TG,TM模型组相比,抑制AP-1通路明显抑制TRAIL的表达。提示ERS诱导的活化巨噬细胞表达TRAIL的表达可能与JNK MAPK及AP-1信号通路有关。3.SOCS3负性调控巨噬细胞ERS诱导的TRAIL的表达为了观察SOCS3对ERS诱导TRAIL的表达的影响,分别根据SOCS3的核苷酸序列序列设计并合成小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)及构建好的p CMV-SOCS3质粒,通过脂质体LipofectamineTM 2000转染到RAW264.7细胞内,荧光倒置显微镜观察细胞的转染效率;RT-PCR检测SOCS3,TRAIL m RNA的水平;Western Blot法检测SOCS3,TRAIL蛋白的水平;ELISA方法检测可溶性TRAIL蛋白的表达变化。实验结果表明,过表达SOCS3可以明显降低ERS诱导的TRAIL的表达上调作用,而沉默的SOCS3可增强ERS诱导的巨噬细胞TRAIL的表达。4.SOCS3通过JNK/AP-1通路负性调节ERS诱导的TRAIL的表达RT-q PCR及Western blot法检测结果发现,分别与TG和TM模型组相比,过表达SOCS3组可明显降低模型组引起的AP-1各组分(c-Jun,c-Fos和Jun B)m RNA及磷酸化蛋白表达的上调,而si RNA沉默SOCS3的表达增强模型组引起的AP-1 m RNA及蛋白的上调作用。进一步给予JNK抑制剂SP600125及AP-1抑制剂SR 1130,Western blot检测结果显示,给予JNK抑制剂SP600125及AP-1抑制剂SR 1130可明显降低TRAIL蛋白的水平。以上结果进一步表明SOCS3可通过JNK/AP-1通路对ERS诱导的巨噬细胞株TRAIL表达负调控。
【关键词】：肝纤维化 巨噬细胞 ERS TRAIL SOCS3
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2

  本文关键词：内质网应激对巨噬细胞肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）表达的调控及其分子机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：340748