肝脏靶向性多功能载体的构建及其急性肝脏免疫损伤的基因治疗

发布时间：2021-10-14 10:31

　　肝脏作为人体最大的内脏器官,具有重要的消化和代谢功能,承担着分泌胆汁、参与糖、脂肪和蛋白质的代谢过程、分解代谢有毒物质的功能。它具有特殊的血液循环系统,能够接受来自门静脉和肝动脉的双重血液供应。肝小叶是肝脏的基本结构单位,肝细胞在其中呈放射状围绕中央静脉排列形成肝板结构,肝板之间是肝血窦。小于100nm的颗粒物可以高效的从血管中进入肝实质细胞。肝脏特殊的解剖学结构以及其重要的生理学功能,使得肝脏成为基因治疗理想的靶器官。随着分子和细胞生物学、病毒学和免疫学的不断发展,众多肝脏疾病的分子遗传发病机制得以解释,除传统的肝细胞移植外,针对众多遗传性或获得性肝脏疾病的基因治疗成为重要手段,具有广泛的应用前景。肝脏的基因治疗面临的最大难题是如何高效安全的将治疗基因导入肝细胞,并能够长期有效表达。因此,对应用于肝脏基因治疗的载体系统进行研究具有重大意义。基因治疗载体系统的选择,既要考虑基因传递的效率和特异性,治疗基因的表达时相,也需要考虑载体进入宿主后所引起的免疫反应以及载体所引起的副作用反应。理想化的肝脏基因治疗载体需要能够特异性的传递治疗基因到肝脏局部,能够实现在静息态的肝细胞中长期稳定表达治... 

【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：126 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
图序
表序
第一章 绪论靶向肝脏的基因治疗
    1.1 肝脏基因治疗概述
        1.1.1 肝脏基因治疗的概念
        1.1.2 肝脏基因治疗的策略
        1.1.3 肝脏基因治疗的疾病应用
        1.1.4 肝脏基因治疗需要考虑的关键问题
        1.1.5 肝脏基因治疗的前景与展望
    1.2 肝脏的靶向基因治疗技术
        1.2.1 肝脏基因治疗的载体系统
        1.2.2 靶向肝细胞定位表达的基因治疗载体
        1.2.3 RNA干扰技术在肝脏靶向基因治疗中的应用
        1.2.4 多功能基因治疗载体的发展和改进
        1.2.5 肝脏基因治疗的候选基因靶点
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 细胞及培养试剂材料
        2.1.3 质粒
        2.1.4 质粒制备抽提试剂盒
        2.1.5 载体构建相关材料及试剂
        2.1.6 病毒载体构建及病毒制备试剂
        2.1.7 真核转染试剂
        2.1.8 荧光素酶报告基因检测试剂
        2.1.9 小鼠肝实质细胞分离相关试剂和材料
        2.1.10 小鼠单个核细胞分离相关试剂和材料
        2.1.11 流式细胞术检测抗体
        2.1.12 血清谷丙转氨酶(ALT)检测试剂
        2.1.13 肝组织病理切片及苏木素-伊红染色试剂
        2.1.14 细胞因子ELISA检测试剂盒
        2.1.15 X-Gal染色检测bacterial galactosidase(LacZ)活性
        2.1.16 RT-PCR 及 real-time qPCR 试齐ij
        2.1.17 其他试剂及材料
    2.2 实验仪器及设备
        2.2.1 小鼠手术器械
        2.2.2 小鼠肝实质细胞、淋巴细胞分离器械
        2.2.3 细胞培养仪器设备
        2.2.4 流式细胞仪
        2.2.5 病理切片仪器设备
        2.2.6 分子克隆仪器设备
        2.2.7 其他仪器设备
    2.3 实验方法
        2.3.1 载体构建及分子克隆
        2.3.2 真核细胞的转染
        2.3.3 真核贴壁细胞的复苏、培养与冻存
        2.3.4 细胞计数
        2.3.5 复制缺陷型腺病毒载体质粒构建、包装及扩增纯化重组腺病毒
        2.3.6 高压尾静脉注射
        2.3.7 冰冻切片技术
        2.3.8 荧光素酶报告基因检测
        2.3.9 X-Gal染色检测bacterial galactosidase(LacZ)活性
        2.3.10 小动物成像系统观察腺病毒体内感染
        2.3.11 血清转氨酶ALT测定(赖氏法)
        2.3.12 ELISA测定细胞因子
        2 3.13 肝组织病理切片及H-E染色
        2.3.14 小鼠肝实质细胞分离
        2.3.15 小鼠单个核细胞分离
        2.3.16 FACS检测细胞表面标志
        2.3.17 小鼠急性肝损伤模型(腺病毒感染、PolyⅠ：C/D-GalN注射)
        2.3.18 统计学分析
第三章 结果与讨论
    3.1 引言
    3.2 肝细胞特异性多功能载体的构建与验证
        3.2.1 肝细胞特异性启动子的选择
        3.2.2 肝细胞特异性启动子与CMV启动子的比较
        3.2.3 肝细胞特异性RNA干扰的实现
        3.2.4 肝细胞特异性多功能载体的构建与验证
    3.3 肝脏靶向性多功能载体有效抑制腺病毒引起的肝脏损伤
        3.3.1 高剂量腺病毒诱导的急性肝损伤
        3.3.2 联合干扰FKN和CCL5有效抑制高剂量腺病毒诱导的急性肝损伤
        3.3.3 联合干扰FKN和表达huIL-10有效抑制高剂量腺病毒诱导的急性肝损伤
        3.3.4 同时干扰FKN/CCL5、表达huIL-10高效抑制高剂量腺病毒诱导的急性肝损伤
        3.3.5 肝脏靶向性多功能载体在腺病毒诱导急性肝损伤模型中的功能验证
        3.3.6 肝脏靶向性多功能载体高效抑制高剂量腺病毒诱导的急性肝损伤
        3.3.7 肝脏靶向性多功能载体能维持长期的保护效果
        3.3.8 肝脏靶向性多功能载体能通过腺病毒进行功能传递
    3.4 肝脏靶向性多功能载体抑制Poly Ⅰ：C/D-GalN诱导的急性肝损伤
        3.4.1 肝脏靶向性多功能载体在poly Ⅰ：C/D-GalN诱导急性肝损伤模型中的功能验证
        3.4.2 肝脏靶向性多功能载体高效抑制Poly Ⅰ：C/D-GalN诱导的急性肝损伤
    3.5 讨论
        3.5.1 肝脏靶向性基因治疗载体的研究进展
        3.5.2 基于microRNA结构的第二代RNA干扰载体
        3.5.3 肝脏靶向性多功能载体在肝脏疾病中的优势
        3.5.4 肝脏基因治疗的前景与展望
参考文献
致谢
攻读博士学位期间的主要研究成果
    发表和拟发表学术论文情况
    发明专利
    攻读博士学位期间参加参加学术会议
    攻读博士学位期间所获得奖励



本文编号：3435983