硫化氢对小鼠原代肝细胞脂肪合成和分解的影响

发布时间：2017-05-04 10:02

  本文关键词：硫化氢对小鼠原代肝细胞脂肪合成和分解的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是代谢综合症中常见的一种疾病,现已成为欧美等发达国家和我国慢性肝病的重要病因,目前还没有理想的预防和治疗药物。在NAFLD的发病机制中,由胰岛素抵抗及其它因素引起的肝脏内脂质合成增加及沉积在疾病的发生发展中占据重要地位。硫化氢(Hydrogen sulfide),化学分子式为H2S,是一种能在人类和哺乳动物细胞内合成的气体分子递质,可调控多种生理及病理生理过程。有研究显示,内源性H2S或外源性H2S供体的补充,可在生理或病理生理条件下影响肝脏正常的脂质代谢。然而,H2S改变及控制肝脏脂质代谢的机制尚不清楚。有文献报道在大鼠脂肪细胞中,抑制胱硫醚γ裂解酶(Cystathionine-gamma-lyase,CSE)/H2S系统可通过PKA-脂肪包被蛋白/激素敏感性脂肪酶(Hormone sensitive lipase,HSL)途径增强脂肪分解作用,增加血脂水平,从而使肝细胞内脂质负荷增加,患NAFLD风险增加。而给予H2S供体则会降低脂肪细胞内的脂肪分解作用,这样就有可能降低NAFLD风险。由此课题组推测,外源性H2S可能会影响到肝细胞内脂肪的合成及分解代谢。肝细胞内脂肪过度蓄积可以抑制细胞自噬,H2S作为一种气体分子递质,可激活细胞自噬,但是否能通过改变肝细胞的自噬水平来调节肝细胞的脂肪代谢目前还不清楚。目的:探究H2S对肝细胞脂肪合成和分解代谢的影响以及细胞自噬对肝细胞脂肪变性的影响,为进一步了解H2S在NAFLD的作用及开发H2S供体治疗药物提供理论依据。方法:两步原位灌流法分离培养C57BL/6小鼠原代肝细胞,体外用油酸(Oleic acid,OA)诱导肝细胞脂肪变性模型。研究H2S对肝细胞脂质合成影响时细胞分四组:对照组,给予等体积的培养液和10%的BSA,用于替换模型组所用的含1.2mmol/L的油酸(溶于10%的BSA)的培养液;模型组,用含1.2mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培养液孵育原代肝细胞48h;H2S组和PAG组是指用含1.2mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培养液孵育原代肝细胞的同时分别给予1mM GYY4137和200μM PAG处理48h。油红染色观察细胞内脂滴变化情况,比色法检测细胞内甘油三酯(TG)含量,观察脂肪分解的实验也分四组:对照组,给予等体积的培养液和10%的BSA,用于替换模型组所II用的含1.2mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培养液;模型组,用含1.2mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培养液孵育原代肝细胞48h;H2S组和PAG组是用含1.2mmol/L油酸(溶于10%的BSA)的培养液孵育原代肝细胞48h,然后换无血清无酚红的RPMI1640培养液同时分别给予1mM GYY4137和200μM PAG处理6h。实验结束时,收集各组细胞培养液检测其中甘油含量,取细胞爬片做LC3免疫荧光,拍摄相差图片;同时离心收集细胞制作电镜标本;用Western blotting方法检测细胞中LC3A/B、HSL和p-HSL的蛋白表达量。结果:1.用含油酸浓度为1.2mmol/L的培养液诱导肝细胞48h,油红染色显示细胞体积增大,轮廓模糊,胞质中有大量脂滴形成,小鼠原代肝细胞脂肪变性模型建立成功。2.在观察脂肪合成的实验中,与对照组相比,模型组肝细胞中甘油三酯含量明显增高(P0.05);而与模型组相比,H2S组和PAG组肝细胞中TG含量无明显变化。3.在观察脂肪分解的实验中,与对照组相比,模型组甘油释放量显著增加(P0.05),,H2S组与模型组相比甘油释放量显著减少(P0.05).Western blotting结果显示,与对照组相比,模型组HSL的磷酸化水平明显升高(P0.05);H2S组与模型组相比,HSL的磷酸化水平显著降低(P0.05)。4.LC3免疫荧光、Western blotting结果显示,H2S促进肝脂肪变性细胞LC3荧光颗粒和蛋白表达增加,相差显微镜下显示细胞内空泡增多,电镜显示自噬溶酶体数量增加。这些结果表明,H2S能够促进原代肝脂肪变性细胞自噬,促进脂质的自噬分解。结论:1.外源性H2S供体GYY4137可通过降低HSL的磷酸化水平,减少脂肪变性肝细胞的脂质细胞溶质分解。2.H2S能够促进脂肪变性肝细胞的脂质自噬,加速细胞的脂质自噬分解。
【关键词】：硫化氢 原代肝细胞 脂肪代谢 自噬
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.5
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-12
• 前言12-14
• 1 材料、试剂和仪器14-24
• 1.1 实验动物14
• 1.2 主要试剂14-16
• 1.3.主要试剂配制16-21
• 1.3.1 肝脏灌流液(无Ca~(2+)/Mg~(2+) HBSS液，pH 7.4)的配方16
• 1.3.2 肝组织消化液的配方16-17
• 1.3.3 胶原酶溶液的配制17
• 1.3.4 原代肝细胞培养基的配制17
• 1.3.5 鼠尾胶原工作液的配制17
• 1.3.6 鼠尾胶原涂抹板的制作17
• 1.3.7 MTT工作液的配制17
• 1.3.8 台盼兰溶液的配制17-18
• 1.3.9 制备肝细胞脂肪变性诱导液18
• 1.3.10 1×磷酸缓冲盐溶液（PBS）的配制18
• 1.3.11 1×Tris-Glycine缓冲溶液的配制18
• 1.3.12 5×蛋白上样缓冲溶液的配制18-19
• 1.3.13 SDS-PAGE电泳相关溶液的配制19-21
• 1.3.14 免疫印迹相关溶液配制21
• 1.4 主要实验仪器21-24
• 2 实验方法与步骤24-30
• 2.1 小鼠原代肝细胞的获取和培养24
• 2.2 MTT法检测不同浓度油酸对小鼠原代肝细胞细胞活性的影响24
• 2.3 实验分组24-25
• 2.4 油红染色25
• 2.5 细胞内甘油三酯含量的检测25
• 2.6 细胞甘油释放量的检测25-26
• 2.7 BCA法测定蛋白浓度26
• 2.8 蛋白免疫印记法（WESTERN BLOTTING）检测相关蛋白的表达26-29
• 2.8.1 蛋白的提取26-27
• 2.8.2 BCA法测定蛋白浓度27
• 2.8.3 蛋白浓度的调节27
• 2.8.4 SDS-PAGE凝胶电泳27-29
• 2.9 免疫荧光检测细胞内LC3颗粒荧光29
• 2.10 透射电镜标本的制备29
• 2.11 统计学分析29-30
• 3 结果30-38
• 3.1 小鼠原代肝细胞脂肪变性模型建立的条件30-31
• 3.1.1 MTT法检测细胞活性选择诱导液中油酸的适宜浓度30
• 3.1.2 油红O染色观察不同浓度油酸对肝细胞脂滴积累情况30-31
• 3.2 H_2S对肝细胞脂肪合成的影响31-32
• 3.2.1 H_2S对肝细胞脂滴的影响31-32
• 3.2.2 H_2S对肝细胞甘油三酯含量的影响32
• 3.3 H_2S对肝细胞脂肪分解的影响32-34
• 3.3.1 H_2S对肝细胞甘油释放量的影响33
• 3.3.2 H_2S对肝细胞质内激素敏感性脂肪酶蛋白表达量的影响33-34
• 3.4 H_2S对肝细胞自噬的影响34-38
• 3.4.1 H_2S对肝细胞脂质蓄积和空泡形成的影响34-35
• 3.4.2 H_2S对肝细胞自噬标志物LC3荧光颗粒的影响35
• 3.4.3 H_2S对肝细胞LC3Ⅰ和LC3Ⅱ蛋白表达的影响35-36
• 3.4.4 H_2S对肝细胞自噬体和自噬溶酶体的影响36-38
• 4 讨论38-44
• 5.结 论44-46
• 参考文献46-50
• 文献综述50-62
• 参考文献57-62
• 附录62-64
• 致谢64-66
• 硕士期间发表的学术论文66-67

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