微小RNA（miRNA）调控乙型（HBV）和丙型（HCV）肝炎病毒基因表达和复制的分子机制研究

发布时间：2021-10-31 22:37

　　调控基因的表达和后续生成对人类病原体的持续和慢性感染至关重要,如乙型肝炎病毒（HBV）,感染全球范围超过4亿人,是导致肝脏疾病的重要原因。在这项研究中,我们首次提供了一个肝脏特异的微小RNA, miR-122,通过碱基配对相互作用方式与一个高度保守的HBV前基因组RNA序列结合,抑制HBV基因表达和复制的直接证据。miR-122的靶序列同时也位于病毒聚合酶mRNA的编码区和核心蛋白mRNA的3,非编码区。培养的细胞中,miR-122表达量的增加导致HBV基因表达和复制的减少,而在HBV复制和感染存在的情况下,miR-122的表达减少。此外,对临床标本的分析表明在HBV阳性患者外周血单核细胞中,miR-122水平和病毒载量之间在体内呈负线性关系。我们的研究结果表明miR-122可通过和病毒靶序列的结合,下调HBV的复制,利于了解HBV持续/慢性感染,并且HBV导致的对miR-122表达的调控可能代表了促进病毒发病机理的机制。一旦病毒的成分被模式识别受体识别,包括Toll样受体（TLRs）和维甲酸诱导基因Ⅰ（RIG-I）样解旋酶,细胞被激活,产生I型干扰素（IFN）和炎性细胞因子。这些途径... 

【文章来源】：武汉大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：165 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
引言
第一部分 综述
    第一章 乙型肝炎病毒
        1.1 HBV的历史背景及其感染的流行病学简介
        1.2 HBV的病毒特征
        1.3 HBV的转录和复制
            1.3.1 HBV的转录
            1.3.2 HBV的复制
        1.4 HBV的免疫发病机理
        1.5 人类宿主中的HBV周期
        1.6 HBV的预防和治疗
            1.6.1 HBV的预防
            1.6.2 HBV的治疗
    第二章 丙型肝炎病毒
        2.1 HCV的结构和基因组
            2.1.1 HCV的结构
            2.1.2 HCV的基因组结构
        2.2 HCV的复制和生命周期
        2.3 HCV细胞内逃避免疫机制
            2.3.1 宿主对感染的反应
            2.3.2 HCV引起的宿主反应
            2.3.3 HCV调控和逃避宿主反应
            2.3.4 HCV调控干扰素通路
            2.3.5 HCV调控ISG的表达或功能
            2.3.6 病毒遗传变异和感染后的宿主反应
            2.3.7 miRNA及HCV感染
            2.3.8 HCV-宿主相互作用模型
    第三章 治疗肝癌的新方法：小分子RNA(miRNA)疗法
        3.1 miRNA和它们在病毒感染中的作用
        3.2 DNA病毒编码的miRNA
            3.2.1 疱疹病毒编码的miRNA
            3.2.2 埃博拉病毒编码的miRNA(EBV)
        3.3 miRNAs编码的其它DNA病毒
            3.3.1 猴肾病毒40(SV40)和其他多瘤病毒
            3.3.2 腺病毒编码的miRNA
        3.4 RNA病毒编码的miRNAs
        3.5 宿主miRNA及其同病毒感染的相互作用
            3.5.1 在病毒感染中起止面调节作用的miRNA
            3.5.2 在病毒感染中起负面调节作用的miRNA
        3.6 miRNA的肝脏生物学
            3.6.1 肝癌中的miRNA表达谱
            3.6.2 miRNA和病毒性肝炎
            3.6.3 肝特异性miRNA：miR-122在肝病中的特征
            3.6.4 肝癌中高表达miRNA：miR-21的特征
            3.6.5 miRNA可做为通用的抗癌治疗因子
第二部分 肝特异性miRNA和HBV的相互作用研究
    第四章 前言
    第五章 在人肝细胞中HBV下调miR-122的表达
        5.1 引言
        5.2 实验材料及仪器
            5.2.1 细胞
            5.2.2 实时定量(Real-Time)PCR检测引物
            5.2.3 工具酶
            5.2.4 其他生物试剂
            5.2.5 化学试剂和仪器
        5.3 实验方法
            5.3.1 哺乳动物细胞培养
            5.3.2 细胞系总RNA提取及Real-Time PCR反应
        5.4 实验结果及讨论
            5.4.1 HepG2.2.15细胞中miR-122表达水平明显低于HepG2细胞
            5.4.2 HepG2.2.15细胞和HepG2细胞miRNA芯片分析结果
    第六章 miR-122抑制HBV基因的表达和复制
        6.1 引言
        6.2 实验材料及仪器
            6.2.1 细菌菌种和质粒
            6.2.2 合成寡核苷酸
            6.2.3 哺乳动物细胞株/系
            6.2.4 细菌/细胞培养基
            6.2.5 化学试剂和实验仪器
            6.2.6 试剂盒和转染试剂
        6.3 实验方法
            6.3.1 哺乳动物细胞转染用高纯度质量的提取(Tiangen试剂盒为例)
            6.3.2 哺乳动物细胞的培养、复苏和冻存(见第五章)
            6.3.3 哺乳动物细胞的转染
            6.3.4 乙肝表面抗原(s),e抗原的检测
            6.3.5 Northern Blot检测HBV RNA水平
            6.3.6 HBV复制中间体(HBV capsid-associated viral DNA)荧光定量PCR检测
        6.4 实验结果及讨论
            6.4.1 通过转染合成寡核苷酸可调节细胞内miR-122的表达水平
            6.4.2 miR-122抑制HBV蛋白的表达
            6.4.3 miR-122可抑制HBV RNA的表达及DNA的复制
    第七章 HBV聚合酶为miR-122的靶mRNA编码基因
        7.1 引言
        7.2 实验材料及仪器
            7.2.1 细菌菌种和质粒
            7.2.2 哺乳动物细胞株/系
            7.2.3 构建所用引物：如表6.1所示
            7.2.4 工具酶、试剂盒及抗体
            7.2.5 其他生物试剂
            7.2.6 化学试剂和仪器
        7.3 实验方法
            7.3.1 哺乳动物细胞转染用高纯质粒提取(见第六章)
            7.3.2 哺乳动物的培养、复苏和冻存(见第六章)
            7.3.3 哺乳动物细胞的转染(见第六章)
            7.3.4 荧光素酶报告基因检测
            7.3.5 蛋白质免疫印迹(Western Blot)
        7.4 实验结果及讨论
            7.4.1 HBV聚合酶基因为miR-122的靶mRNA编码基因
            7.4.2 miR-122也通过类似的机制调控adw亚型的HBV基因表达和复制
    第八章 miR-122通过与HBV的靶RNA序列碱基配对的相互作用调控HBV感染
        8.1 引言
        8.2 实验材料及仪器
            8.2.1 细菌菌种和质粒
            8.2.2 哺乳动物细胞株/系
            8.2.3 构建所需引物及合成寡合甘酸：如表8.1所示
            8.2.4 试剂及仪器
        8.3 实验方法
            8.3.1 哺乳动物细胞转染用高纯质粒提取(见第六章)
            8.3.2 哺乳动物的培养、复苏和冻存(见第六章)
            8.3.3 哺乳动物细胞的转染(见第六章)
            8.3.4 乙肝表面抗原(s),e抗原的检测(见第六章)
            8.3.5 HBV复制中间体(HBV capsid-associated viral DNA)荧光定量PCR检测(见第六章)
            8.3.6 一步法突变构建HBV1.3倍体上miR-122靶标序列的相应特异性位点突变体
            8.3.7 Northern Blot检测HBV与miR-122的杂交
        8.4 实验结果和讨论
    第九章 体内HBV感染和miR-122表达水平的相关性研究
        9.1 引言
        9.2 实验材料及仪器
            9.2.1 临床标本
            9.2.2 试剂和仪器
        9.3 实验方法
            9.3.1 miRNA检测(见第五章)
            9.3.2 血样中外周血单核细胞(PBMC)的分离
            9.3.3 血样中HBV病毒载量的荧光定量PCR检测
        9.4 实验结果和讨论
    第十章 总论
第三部分 在癌症中普遍上调的miRNA和HCV的相互作用研究
    第十一章 前言
    第十二章 HCV的感染上调miR-21的表达
        12.1 引言
        12.2 实验材料及仪器
            12.2.1 细菌菌种,质粒和病毒
            12.2.2 哺乳动物细胞株/系
            12.2.3 试剂及仪器
        12.3 实验方法
            12.3.1 哺乳动物细胞转染用高纯质粒提取(见第六章)
            12.3.2 哺乳动物细胞的培养、复苏和冻存(见第六章)
            12.3.3 哺乳动物细胞的转染(见第六章)
            12.3.4 miRNA检测(见第五章)
            12.3.5 外周血淋巴细胞(PBMC)的分离和培养
            12.3.6 HCV的感染和保存
            12.3.7 pFL-J6/JFH-1的线性化,体外转录及转染
        12.4 实验结果及讨论
    第十三章 miR-21可抑制HCV触发的Ⅰ型干扰素产物的表达
        13.1 引言
        13.2 实验材料及仪器
            13.2.1 合成寡核苷酸和实验所需引物
            13.2.2 病毒,试剂盒和抗体
            13.2.3 其它材料和仪器
        13.3 实验方法
            13.3.1 细胞上清中IFN-α蛋白含量的ELISA检测
            13.3.2 半定量PCR检测
            13.3.3 其它实验方法
        13.4 实验结果及讨论
            13.4.1 在肝细胞内miR-21抑制HCV触发的Ⅰ型干扰素产物的合成
            13.4.2 miR-21通过拮抗HCV引起的IFN-α抗病毒反应促进HCV的复制
            13.4.3 miR-21的过表达可抑制IFN-α引起的抗病毒反应
    第十四章 MyD88和IRAK1为miR-21的靶标基因
        14.1 引言
        14.2 实验材料及仪器
            14.2.1 合成寡核苷酸及实验所需引物
            14.2.2 哺乳动物细胞
            14.2.3 质粒
            14.2.4 其它实验试剂及仪器
        14.3 实验方法
            14.3.1 3’UTR荧光素酶报告系统的构建
            14.3.2 流式细胞检测
            14.3.3 其它实验方法
        14.4 实验结果及讨论
            14.4.1 miR-21调节TLR-7信号级联通路中各组成成分的基因表达
            14.4.2 MyD88和IRAK1为miR-21的靶标
            14.4.3 miR-21对IFN信号通路的调控受MyD88和IRAK1介导
    第十五章 总论
参考文献
攻博期间发表和待发表的论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Clinical relevance and public health significance of hepatitis B virus genomic variations[J]. Guang-Wen Cao, Department of Epidemiology, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China.  World Journal of Gastroenterology. 2009(46)
[2]Inhibition of hepatitis B virus gene expression and replication by artificial microRNA[J]. Yu-Feng Gao, Li Yu, Wei Wei, Ji-Long Shen, Institute of Clinical Pharmacology, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China Yu-Feng Gao, Li Yu, Qing-Li Luo, Ji-Long Shen, Anhui Key Laboratory of Zoonoses, Hefei 230032, Anhui Province, China Yu-Feng Gao, Li Yu, Qing-Li Luo, Ji-Long Shen, The Key Laboratory of Gene Resource Utilization for Severe Diseases, The Ministry of Education of China and Anhui Province, Hefei 230032, Anhui Province, China Yu-Feng Gao, Jia-Bin Li, Department of Infectious Diseases, The First Aff iliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui Province, China.  World Journal of Gastroenterology. 2008(29)
[3]Interaction of hepatitis C virus with the type I interferon system[J]. Friedemann Weber.  World Journal of Gastroenterology. 2007(36)
[4]Hepatitis C virus proteins[J]. Jean Dubuisson.  World Journal of Gastroenterology. 2007(17)
[5]Hepatocellular carcinoma: Therapy and prevention[J]. Hubert E Blum.  World Journal of Gastroenterology. 2005(47)
[6]Effect of hepatitis Bimmunoglobulin on interruption of HBV intrauterine infection[J]. Xiao-Mao Li Yue-Bo Yang Zhong-Jie Shi Hong-Ying Hou Hui-Min Shen Ben-Qi Teng,Department of Obstetrics and Gynecology,Third Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510630,Guangdong Province,ChinaMin-Feng Shi,Women’s Hospital,School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310006,Zhejiang Province,China.  World Journal of Gastroenterology. 2004(21)
[7]Interruption of HBV intrauterine transmission:A clinical study[J]. Xiao-Mao Li Yue-Bo Yang Hong-Ying Hou Zhong-Jie Shi Hui-Min Shen Ben-Qi Teng Ai-Min Li Ling Zou Department of Obstetrics and Gynecology,The Third Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University,Guangzhou 510630,Guangdong Province,China Min-Feng Shi Maternity Hospital,School of Medicine,Zhejiang University,Hangzhou 310006,Zhejiang Province,China.  World Journal of Gastroenterology. 2003(07)



本文编号：3468989