肝硬化门脉高压下miR-9a-5p介导的肝星状细胞的持续活化的研究

发布时间：2017-05-08 06:35

  本文关键词：肝硬化门脉高压下miR-9a-5p介导的肝星状细胞的持续活化的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景与目的门脉高压症是一种血液动力学异常疾病,表现为门静脉压力增高进一步导致腹水、食管胃底静脉曲张及脾肿大,也可伴有多种并发症如上肝性脑病、消化道出血及肝。肾综合征。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的持续激活是肝硬化门脉高压症的发生发展的关键环节。肝星状细胞具有很强的收缩性,主要表现在调节肝窦血流方面,其作用类似于平滑肌细胞。其机制是肝星状细胞分泌大量细胞外基质和向肝实质细胞迁移,造成肝细胞肿胀和血管阻力增加,进而造成门脉压力的增高。miRNA是最近几年研究较多的一类非编码小RNA,长度大约在22nt,主要机制是结合靶基因的3'UTR端,通过抑制其表达从而调控细胞的功能。在肝纤维化的研究中也发现,miRNA在HSC的活化、增殖及凋亡中发挥着重要的调节作用。但是,在HSC对门脉高压的力学响应中miRNA是否起作用,目前国内外均尚未见报道。因此,本论文研究目的旨在研究miRNA在肝星状细胞门脉高压时生物力学应答中所起的调节作用,为门脉高压的防治提出新的思路和策略,为miRNA在肝硬化门脉高压防治上提供了理论基础和应用的可能性。本研究应用HSC压力加载模型,通过miRNA二代测序技术检测HSC力学加载前后miRNA表达谱(加载的HSC选用14天完全活化的细胞)。在这些差异表达的miRNAs之中,miR-9a-5p能够明显的升高,并通过RT-PCR验证。我们的前期研究结果也发现,压力(10 mmHg压力作用1h)能显著促进HSC的增殖、活化和迁移(10 mmHg为门脉高压发生的临界压力值),其作用可能是通过Integrin-FAK途径实现,而AKT又是其下游通路。通过转染miR-9a-5p,研究肝星状细胞在压力下改变miR-9a-5p的表达后对其活化、迁移与增殖功能的影响及机制。该研究一共分三个部分：(1)原代大鼠肝星状细胞的分离和鉴定；(2)压力诱导肝星状细胞microRNA表达谱及生物信息学分析；(3)miR-9a-5p在肝硬化门脉高压中的作用及其相关调控机制的研究。方法1 原代肝星状细胞培养与鉴定：刚分离的原代细胞以1×105cells/cm2种植于20%的FBS培养液中,培养48h后,将培养液更换为含10%的FBS。每隔一天换一次液体。培养2天内的细胞均为静息期,第14天为完全活化细胞。原代细胞纯度鉴定通过自发免疫荧光和抗Desmin和a-SMA的细胞免疫荧光。2 压力加载：取培养14天的原代肝星状细胞置于压力装置内,分别连接氮气和血压计,并开启血压计缓慢注入氮气,压力上升至10 mmHg后,关闭阀门密封容器,加载1小时可用于后续实验。2.1 压力诱导肝星状细胞microRNA表达谱及生物信息学分析：2.2 肝星状细胞体外培养14天作为对照组HSC；培养14天后在10mmHg下作用1小时作为压力组HSC。2.3 生物信息学分析：Gene ontology(GO)分析--应用GO数据库对差异基因进行分析,取得有可能参与的功能,并寻找microRNA与差异基因可能的关系：pathway分析—根据KEGG等数据库,得到表达显著的信号通路,并寻找microRNA与信号通路可能的关系。3 miR-9a-5p在压力作用下肝星状细胞与大鼠肝硬化肝组织中的验证3.1 HSC在压力作用下miR-9a-5p的表达检测：应用RT-PCR技术检测压力作用的HSC与正常培养HSC的miR-9a-5p的表达量变化。3.2 miR-9a-5p在晚期肝硬化大鼠肝组织中的表达分析3.2.1 CCl4肝硬化动物模型的构建：对照组每周两次腹腔注射橄榄油2ml/kg,实验组每周两次腹腔注射40%CCl4 2ml/kg。首剂量加倍,正常饮水摄食。一共八周。3.2.2应用RT-PCR技术检测正常大鼠肝组织与肝硬化大鼠肝组织的miR-9a-5p的表达量变化。4 压力作用下对HSC功能的检测4.1 使用RT-PCR方法,检测肝星状细胞在压力作用下,a-SMA mRNA与Type I collagen表达量的改变。4.2 使用western blot方法,检测肝星状细胞在压力作用下,a-SMA mRNA与Type I collagen表达量的改变。5 MiRNA mimics和inhibitors转染转染进入细胞用瑞博FECTTM CP试剂盒,miR-9a-5pinhibitor和mimic购买自广州瑞博公司,转染浓度分别为100nM和50nM。转染24-48小时后收集细胞。6 压力作用下对HSC增殖的检测miR-9a-5p转染与压力作用1小时后,1×105cells/ml密度种植于96孔板中并培养24、48和72小时,用CCK-8试剂盒检测细胞的增殖率。7 压力作用下对HSC迁移的检测Transwell:miR-9a-5p转染与压力作用1小时后,以5×103cells/well接种100 ul细胞悬液于Transwell 24孔培养板中,蓝染Transwell的上部和底部细胞膜。迁移后24小时,用显微镜随机选取5个视野观察计算迁移细胞数目。8 miR-9a-5p的靶基因寻找及验证应用荧光素酶报告基因与western blot检测miR-9a-5p与Sirtl之间存在靶向关系。9 统计学分析所有数据均用均数±标准差表示,三样本独立重复。两组数据比较用t检验,三组或多组数据用单因素方差分析。数据用SPSS16.0软件处理,p≤0.05被视为有统计学意义。结果1 原代肝星状细胞鉴定和培养：分离的原代HSC种植于培养皿后,表现为形态均一的发光的小圆形细胞,体积远小于肝细胞。培养当天细胞可大部分贴壁,表现为富含脂肪颗粒的椭圆形。培养第7天细胞可伸展为细长型.培养第14天,细胞可向四周伸展,并表现为明显的星状.在细胞贴壁2天左右,328 nm紫外光照射下,细胞表现为黄绿色荧光,培养14天做细胞免疫荧光,Desmin和α-SMA均为表达阳性。2 microRNA在压力作用肝星状细胞下的表达谱及生物信息学分析2.1 18个microRNA (miR-206-3p、miR-210-3p、miR-494-5p、miR-345-3p、 miR-592、miR-124-3p、miR-429、miR-34c-5p、miR-34b-5p、miR-34a-3p、 miR-450a-3p、miR-199a-5p、miR-222-3p、miR-450a-5p、-miR-34a-5p、 miR-494-3p、miR-377-5p、miR-9a-5p)在压力作用肝星状细胞中表达升高；7个microRNA(miR-26a-3p、miR-222-5p、miR-335、miR-194-3p、 miR-103-1-5p、miR-664-1-5p、miR-188-3p)在压力作用肝星状细胞中表达降低。2.2 GO分析和pathway分析：15个GOs被上调的miRNAs调控,15个GOs被下调的miRNAs调控。所有的miRNAs调控的GOs与细胞周期、成纤维细胞增殖的负反馈调节、自噬正反馈调节、视黄酸反应、K48蛋白脱泛素化、K63蛋白脱泛素化、基因表达的负反馈调节。miRNAs调节的关键信号通路：RNA转运、粘附斑激酶、白细胞介素信号通路、细胞粘附分子等。3 miR-9a-5p在压力作用下肝星状细胞与大鼠肝硬化肝组织中的验证应用RT-PCR证实：压力作用的HSC比正常培养HSC的miR-9a-5p的表达量显著升高,与二代测序结果一致。肝硬化大鼠肝组织比正常大鼠肝组织的miR-9a-5p表达量显著升高。4 miR-9a-5p在压力作用下对HSC功能的影响应用RT-PCR和western blot证实,转染miR-9a-5p进入14天活化肝星状细胞,压力作用1小时后,a-SMA和Type I collagen的表达量受到miR-9a-5p的抑制(p0.05)。5 miR-9a-5p在压力作用下对HSC增殖的影响CCK-8实验表明,抑制miR-9a-5p,可以明显抑制压力作用HSC的增殖。6 miR-9a-5p在压力作用下对HSC迁移的影响Transwell实验表明,抑制miR-9a-5p,可以明显抑制压力作用HSC的迁移。7 miR-9a-5p的靶基因寻找及验证荧光素酶报告显示,经过miR-9a-5p mimic处理的野生型Sir13'UTR是明显的降低。Western blot也证实,转染miR-9a-5p inhibitor, Sirtl蛋白表达升高；转染miR-9a-5p mimic, Sirtl蛋白表达降低。8 Sirtl在压力作用细胞和晚期肝硬化大鼠肝组织中的表达分析通过RT-PCR和免疫组化证实,Sirtl的表达量在压力处理的肝星状细胞和大鼠肝纤维化晚期组织中明显降低。9 miR-9a-5p参与了在压力作用下PI3K-AKT信号通路对HSC的调节Western blot证实,PI3K通路抑制剂LY294002能够在压力作用下显著抑制AKT磷酸化。通过RT-PCR进一步证实,LY294002也能够使miR-9a-5p的表达量降低。结论1 通过二代测序技术和RT-PCR筛选出压力作用下14天活化肝星状细胞的miRNAs的表达,其中miR-9a-5p的表达量显著升高。通过构建肝纤维化大鼠模型证实,miR-9a-5p在组织中表达量也是升高。荧光素酶报告和western blot证实miR-9a-5p的靶基因为Sirtl,在细胞与组织中均降低。2 抑制miR-9a-5p的表达,能够显著抑制HSC的活化、增殖和迁移。过表达Sirtl能够抑制HSC的活化。可能通过下调Sirtl的表达量来实现的。3 通过对压力作用下Akt磷酸化的抑制,发现miR-9a-5pde表达量降低。而在Erkl/2抑制剂的作用下,miR-9a-5p表达量没有改变。
【关键词】：microRNA miR-9a-5p Sirt1 肝星状细胞 活化 增殖 迁移 压力
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 摘要6-10
• Abstract10-16
• 缩略词表16-17
• 前言17-20
• 参考文献18-20
• 第一部分 大鼠肝星状细胞的分离与鉴定20-29
• 前言20-21
• 材料与方法21-24
• 结果24-26
• 讨论26-27
• 第一部分 小结27-28
• 参考文献28-29
• 第二部分 压力诱导肝星状细胞microRNA表达谱及生物信息学分析29-48
• 前言29-31
• 材料和方法31-36
• 结果36-43
• 讨论43-45
• 第二部分 小结45-46
• 参考文献46-48
• 第三部分 压力诱导miR-9a-5p介导的肝星状细胞持续活化的分子机理研究48-68
• 前言48-49
• 材料和方法49-55
• 结果55-63
• 讨论63-65
• 第三部分 小结65-66
• 参考文献66-68
• 全文总结68-69
• 综述69-78
• 参考文献73-78
• 在读期间发表或待发表文章78
• 在读期间参加课题78-79
• 致谢79

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 罗海峰,吴志勇,陈炜,邱江锋,张燕;大鼠肝星状细胞的原代分离、培养与鉴定[J];肝胆胰外科杂志;2003年04期

2 陈超;陈宁;覃霞;朱j;;一种改良的肝星状细胞分离方法[J];胃肠病学和肝病学杂志;2011年06期

  本文关键词：肝硬化门脉高压下miR-9a-5p介导的肝星状细胞的持续活化的研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：350606