丙型肝炎病毒NS5A蛋白核酸适体抗病毒作用机制

发布时间：2017-05-12 19:18

  本文关键词：丙型肝炎病毒NS5A蛋白核酸适体抗病毒作用机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：全球大约有1.7亿人感染丙型肝炎病毒(HCV),其中80%感染者将转变成为慢性感染。HCV感染可导致慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌。目前对HCV感染尚无有效疫苗，并且临床上聚乙二醇化α-干扰素(pegylated interferon alpha，PEG-IFNα)和利巴韦林(ribavirin，RBV)联合使用的标准HCV治疗方案治疗周期较长，患者不良反应较严重。所以，有必要开发安全、有效且对HCV感染耐受良好的治疗药物。 NS5A蛋白在HCV生活周期中参与病毒RNA的复制和病毒颗粒的形成。由此可见，以NS5A蛋白作为抗HCV新型药物的靶点，存在巨大潜力。核酸适体（aptamer）是一类新型识别分子，有较强亲和力和较高的选择性，几年来在生物检测和新药开发等方面应用广泛。 本文以NS5A为靶标蛋白，筛选出与之特异结合的aptamers，研究其对HCV生活周期的影响，，并对aptamers的抗病毒机制做了初步的研究。本文将已构建好的重组质粒pET28b-NS5A转到BL21大肠杆菌感受态细胞中进行蛋白表达，利用重组蛋白上连接的His标签，用镍柱纯化得到目的蛋白。以纯化的NS5A为靶蛋白，经过8轮筛选，得到特异性结合的ssDNA aptamers。从中选择五条（NS5A-1、NS5A-2、NS5A-3、NS5A-4、NS5A-5）进行分析，发现这五条aptamers能够特异结合到NS5A蛋白上，且不与对照蛋白LacZ发生非特异性结合。利用分子生物学和免疫学方法检测aptamers处理后细胞中的病毒RNA复制和病毒颗粒组装或释放的变化。将NS5A蛋白分段真核表达，利用细胞内竞争实验初步确定NS5A aptamers和NS5A的结合区域。确定aptamers和NS5A的结合区段后，进一步对aptamers能够抑制病毒颗粒产生的机制进行研究。结果表明NS5A-4结合NS5A Domain I，对病毒RNA的复制有明显的抑制作用，并且能抑制NS5A在脂滴上的定位。NS5A-5对病毒颗粒的组装有抑制作用，通过抑制NS5A和Core的结合及病毒蛋白与病毒RNA的结合而实现。 结论：NS5A aptamers通过抑制NS5A在脂滴上的定位以及与Core蛋白之间的相互结合，发挥抗病毒作用。针对NS5A aptamers抗病毒作用机制的研究能帮助我们更深入了解HCV生活周期，从而为HCV靶向治疗的研究提供新思路。
【关键词】：丙型肝炎病毒 NS5A蛋白 核酸适体 抗病毒
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R512.63
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-20
• 1.1 丙型肝炎病毒（HCV）及其研究概况10-16
• 1.1.1 丙型肝炎病毒基因组结构和蛋白的功能10-11
• 1.1.2 丙型肝炎病毒生活周期11-13
• 1.1.3 丙型肝炎流行现状13
• 1.1.4 抗丙型肝炎病毒药物的研究13-16
• 1.2 丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A 的研究概况16-17
• 1.3 核酸适体在生物医药研究中的应用17-19
• 1.4 本课题研究方案及目的19-20
• 第2章 丙型肝炎病毒全长 NS5A 蛋白原核表达及纯化20-26
• 2.1 前言20
• 2.2 材料与方法20-24
• 2.2.1 实验材料20-21
• 2.2.2 实验方法21-24
• 2.3 实验结果24
• 2.4 小结与讨论24-26
• 第3章 NS5A 蛋白核酸适体的筛选26-30
• 3.1 前言26
• 3.2 材料与方法26-28
• 3.2.1 实验材料26
• 3.2.2 实验方法26-28
• 3.3 实验结果28-29
• 3.3.1 不同筛选轮数 aptamers 和蛋白的结合情况28
• 3.3.2 Aptamers 和 NS5A 蛋白的亲和性的检测28-29
• 3.4 小结与讨论29-30
• 第4章 NS5A 核酸适体对 HCV 生活周期的影响30-45
• 4.1 前言30
• 4.2 材料与方法30-37
• 4.2.1 实验材料30-31
• 4.2.2 实验方法31-37
• 4.3 实验结果37-43
• 4.3.1 NS5A aptamers 抑制 FCA1 细胞中复制子的复制37-39
• 4.3.2 NS5A aptamers 影响可感染 HCV 细胞系中病毒 RNA 的复制以及病毒颗粒的组装39-41
• 4.3.3 NS5A aptamers 影响不同基因亚型 HCV RNA 的复制41-42
• 4.3.4 NS5A aptamers 不影响 HepG2.2.15 细胞系中 HBV DNA 的复制42-43
• 4.4 小结与讨论43-45
• 第5章 NS5A 核酸适体抗病毒机制的探究45-62
• 5.1 前言45-46
• 5.2 材料与方法46-53
• 5.2.1 实验材料46-47
• 5.2.2 实验方法47-53
• 5.3 实验结果53-60
• 5.3.1 pEF6/V5-His TOPO-NS5A DI、pEF6/V5-His TOPO-NS5A DI-II、pEF6/V5-His TOPO-NS5A DI-III 重组质粒的构建53-57
• 5.3.2 NS5A Domain I 与 NS5A-4 的抗病毒作用有关57-58
• 5.3.3 NS5A-4 抑制细胞内病毒 NS5A 在 LDs 上的定位58
• 5.3.4 NS5A-5 抑制细胞内 HCV NS5A 与 Core 蛋白的相互作用58-59
• 5.3.5 NS5A aptamers 抑制细胞内 HCV Core 蛋白与 RNA 的结合59-60
• 5.4 小结与讨论60-62
• 结论62-63
• 参考文献63-71
• 致谢71-72
• 附录 攻读学位期间参与项目及发表论文72

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本文编号：360628