重组人IFNα2b/IgG4 Fc融合蛋白在杆状病毒昆虫系统中的表达
发布时间:2022-05-12 17:41
背景和目的慢性乙型病毒性肝炎是一种严重危害人类健康的常见病,全球目前约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒感染者;慢性丙型病毒性肝炎亦影响着全球近1.8亿人,该病的危险性主要在于其高慢性化率和可能发生的严重并发症,包括肝硬化和肝癌。病毒性肝炎的防治是一个全球性公共卫生问题,已引起世界各国的关注。干扰素(interferon, IFN)是目前公认的有效抗病毒药物,迄今在临床上已经使用了20多年。然而,作为一个小分子蛋白,干扰素从血浆中清除的速度较快,其清除相半衰期为注射后的3~8h,24h后在血浆中就已检测不到其存在,导致在临床治疗中需要重复多次给药才能达到治疗效果,造成临床应用中的一些不利。因此延长IFNa的半衰期,降低其副作用对IFNa的临床应用具有重要意义。目前延长干扰素半衰期的方法主要有聚乙二醇(PEG)修饰法、融合蛋白法。近年来,人们关注抗体IgG Fc段与干扰素融合蛋白(IFN/Fc)的生物学活性和药理作用。这两种干扰素融合蛋白的研制受到国内外学者的广泛关注,作为一种新的基因工程药物在表达系统建立和蛋白质纯化等方面进行了前沿性研究。本课题基于近几年蛋白质表达系统的研究进展,通过分子克隆...
【文章页数】:65 页
【学位级别】:硕士
【文章目录】:
摘要
Abstract
前言
第一部分 重组杆状病毒穿梭载体的构建及杆粒的获得
1 材料
1.1 主要仪器设备
1.2 主要试剂/试剂盒
1.3 主要培养基及液体试剂的配制
2 方法
2.1 重组穿梭载体pFastBac1-IFN/Fc的构建
2.1.1 引物设计
2.1.2 细胞总RNA的提取
2.1.3 IFNα2b及IgG4 Fc基因的扩增
2.1.4 目的基因克隆至表达载体pFastBac1
2.2 重组杆粒Bacmid-IFN/Fc的获得
2.2.1 DH10 Bac感受态细胞的制备
2.2.2 转座重组
3 结果
3.1 重组穿梭载体pFastBac1-IFN/Fc的鉴定
3.1.1 重组穿梭载体构建
3.1.2 重组穿梭载体pFastBac1-IFN/Fc的鉴定
3.2 重组杆粒Bacmid-IFN/Fc的鉴定
4 讨论
5 结论
第二部分 重组融合蛋白IFN/Fc在昆虫细胞中的表达与检测
1 材料
1.1 主要仪器设备
1.2 主要试剂/试剂盒
2 方法
2.1 重组杆状病毒的获得
2.1.1 High Five细胞的培养及传代
2.1.2 重组杆粒Bacmid-IFN/Fc转染High Five细胞
2.2 融合蛋白IFN/Fc的表达与检测
2.2.1 融合蛋白IFN/Fc的获得
2.2.2 ELISA鉴定
2.2.3 Western-Blot鉴定
2.2.4 体外抗病毒活性测定
3 结果
3.1 重组杆状病毒的包装
3.2 融合蛋白IFN/Fc的表达与检测
3.2.1 ELISA鉴定融合蛋白IFN/Fc
3.2.2 Western-Blot鉴定融合蛋白IFN/Fc
3.2.3 体外抗病毒活性测定
4 讨论
5 结论
附图
参考文献
综述
参考文献
英文缩略词表
攻读学位期间发表文章情况
致谢
个人简历
【参考文献】:
期刊论文
[1]干扰素在病毒性肝炎治疗中的地位及前景[J]. 张定凤. 中华肝脏病杂志. 2011 (01)
[2]干扰素在病毒性肝炎治疗中的联合应用[J]. 赵钢德,谢青. 中华肝脏病杂志. 2011 (01)
[3]Insect Cell Culture and Biotechnology[J]. Robert R.Granados,G.W.Blissard1. Virologica Sinica. 2007(02)
[4]融合蛋白IFN-IgGFc在乳酸乳杆菌中的表达及其生物学活性研究[J]. 高绪文,陈辉,贾润清,姚立红,马长伟,张智清. 食品科学. 2007(01)
本文编号:3652719
【文章页数】:65 页
【学位级别】:硕士
【文章目录】:
摘要
Abstract
前言
第一部分 重组杆状病毒穿梭载体的构建及杆粒的获得
1 材料
1.1 主要仪器设备
1.2 主要试剂/试剂盒
1.3 主要培养基及液体试剂的配制
2 方法
2.1 重组穿梭载体pFastBac1-IFN/Fc的构建
2.1.1 引物设计
2.1.2 细胞总RNA的提取
2.1.3 IFNα2b及IgG4 Fc基因的扩增
2.1.4 目的基因克隆至表达载体pFastBac1
2.2 重组杆粒Bacmid-IFN/Fc的获得
2.2.1 DH10 Bac感受态细胞的制备
2.2.2 转座重组
3 结果
3.1 重组穿梭载体pFastBac1-IFN/Fc的鉴定
3.1.1 重组穿梭载体构建
3.1.2 重组穿梭载体pFastBac1-IFN/Fc的鉴定
3.2 重组杆粒Bacmid-IFN/Fc的鉴定
4 讨论
5 结论
第二部分 重组融合蛋白IFN/Fc在昆虫细胞中的表达与检测
1 材料
1.1 主要仪器设备
1.2 主要试剂/试剂盒
2 方法
2.1 重组杆状病毒的获得
2.1.1 High Five细胞的培养及传代
2.1.2 重组杆粒Bacmid-IFN/Fc转染High Five细胞
2.2 融合蛋白IFN/Fc的表达与检测
2.2.1 融合蛋白IFN/Fc的获得
2.2.2 ELISA鉴定
2.2.3 Western-Blot鉴定
2.2.4 体外抗病毒活性测定
3 结果
3.1 重组杆状病毒的包装
3.2 融合蛋白IFN/Fc的表达与检测
3.2.1 ELISA鉴定融合蛋白IFN/Fc
3.2.2 Western-Blot鉴定融合蛋白IFN/Fc
3.2.3 体外抗病毒活性测定
4 讨论
5 结论
附图
参考文献
综述
参考文献
英文缩略词表
攻读学位期间发表文章情况
致谢
个人简历
【参考文献】:
期刊论文
[1]干扰素在病毒性肝炎治疗中的地位及前景[J]. 张定凤. 中华肝脏病杂志. 2011 (01)
[2]干扰素在病毒性肝炎治疗中的联合应用[J]. 赵钢德,谢青. 中华肝脏病杂志. 2011 (01)
[3]Insect Cell Culture and Biotechnology[J]. Robert R.Granados,G.W.Blissard1. Virologica Sinica. 2007(02)
[4]融合蛋白IFN-IgGFc在乳酸乳杆菌中的表达及其生物学活性研究[J]. 高绪文,陈辉,贾润清,姚立红,马长伟,张智清. 食品科学. 2007(01)
本文编号:3652719
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