携带产气荚膜梭菌分泌蛋白基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗的研究

发布时间：2022-12-11 14:44

　　坏死性肠炎（Necrotic Enteritis,NE）是由产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）引起的一类非常重要的肉鸡疾病,发病率可达30%以上,病死率为18%～31%,目前尚未研制出有效的防制疫苗。研究发现某些由强毒产气荚膜梭菌菌株产生的特有分泌蛋白具有一定的免疫原性,肌内注射或者口服免疫这些免疫原蛋白对强毒产气荚膜梭菌攻毒引起的试验性NE有免疫保护作用。因此,本研究目的就是通过分离和鉴定免疫原性分泌蛋白,评价其对NE的重要性及免疫原性;评价构建的携带产气荚膜梭菌免疫原性分泌蛋白基因的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗的免疫效果,从而为NE的减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗研制提供一定的依据。 （1）通过运用SDS-PAGE蛋白电泳方法分离强毒株和弱毒株的分泌蛋白,然后与阳性NE免疫鸡血清进行Western blot反应,将强毒株特有的3条有较强免疫反应蛋白条带切割,进行质谱分析鉴定。分离鉴定了3种强毒产气荚膜梭菌菌株所特有的分泌蛋白,分别是toxin C.perfringens large cytotoxin（TpeL）, Endo-beta-N-acety... 

【文章页数】：120 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
文献综述
    第一章 产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎研究进展
        1.1 人类和动物的梭菌感染
            1.1.1 与毒力有关的产气荚膜梭菌的毒素和酶
            1.1.2 产气荚膜梭菌的全基因组序列
            1.1.3 产气荚膜梭菌的VirR/VirS 调节系统
        1.2 鸡坏死性肠炎
            1.2.1 NE 株的分子分型
            1.2.2 NE 的诱因
            1.2.3 NE 的发病机制
            1.2.4 NE 的防制
        1.3 产气荚膜梭菌感染的免疫保护
            1.3.1 α-毒素在产气荚膜梭菌感染的免疫保护力的作用
        1.4 活的口服减毒沙门氏菌重组载体疫苗
            1.4.1 沙门氏菌载体
            1.4.2 质粒载体
            1.4.3 异源性抗原表达及其免疫原性
            1.4.4 细胞抗原表达的位置
        1.5 论文设计思路及研究方法
试验研究
    第二章 A 型产气荚膜梭菌几种分泌蛋白的分离鉴定
        2.1 材料
            2.1.1 菌株及血清抗体
            2.1.2 主要试剂及试剂盒
            2.1.3 培养基
            2.1.4 SDS-PAGE 及Western blot 缓冲液的配制
            2.1.5 仪器设备
        2.2 方法
            2.2.1 分泌蛋白的沉淀及浓缩
            2.2.2 SDS-PAGE 电泳
            2.2.3 Western blot
            2.2.4 蛋白质质谱分析
        2.3 结果
            2.3.1 A 型产气荚膜梭菌外毒素粗提
            2.3.2 CP4 外毒素的SDS-PAGE 和Western blot 的分析结果
            2.3.3 三种分泌蛋白的质谱分析结果
        2.4 讨论
        2.5 小结
    第三章 重组蛋白的表达纯化及对肉鸡NE 的免疫保护效果
        3.1 材料
            3.1.1 菌种、质粒和载体
            3.1.2 主要试剂及试剂盒
            3.1.3 仪器设备
            3.1.4 培养基
            3.1.5 缓冲液
            3.1.6 实验动物
        3.2 方法
            3.2.1 基因克隆
            3.2.2 重组蛋白的过量表达
            3.2.3 重组蛋白的分离纯化
            3.2.4 SDS-PAGE 及Western blot 分析
            3.2.5 重组蛋白的免疫试验
            3.2.6 血清生长抑制试验
            3.2.7 鸡血清抗体滴度的测定
        3.3 结果
            3.3.1 目的基因的克隆
            3.3.2 表达质粒载体的构建
            3.3.3 重组蛋白的表达条件优化
            3.3.4 6×His-tagged 重组蛋白的纯化
            3.3.5 重组蛋白的浓缩
            3.3.6 免疫鸡对攻毒诱导的坏死性肠炎的免疫保护性
            3.3.7 重组抗原诱导免疫鸡的抗原特异性的抗体免疫反应
            3.3.8 血清细菌生长抑制试验结果
        3.4 讨论
        3.5 小结
    第四章 减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗对NE 的免疫保护效果
        4.1 材料
            4.1.1 实验动物
            4.1.2 菌株及质粒
            4.1.3 试剂及培养基
            4.1.4 各种溶液的配制
        4.2 方法
            4.2.1 疫苗株的准备
            4.2.2 动物饲养管理
            4.2.3 疫苗免疫试验
            4.2.4 病理剖检
            4.2.5 抗体滴度的ELISA 测定
        4.3 结果
            4.3.1 免疫鸡对试验诱导的NE 的免疫保护性
            4.3.2 疫苗免疫诱导的抗原特异性抗体免疫反应
        4.4 讨论
        4.5 小结
    第五章 减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗对沙门氏菌的免疫保护效果
        5.1 材料
            5.1.1 实验动物
            5.1.2 菌株
            5.1.3 药品试剂
            5.1.4 培养基及溶液的配制
        5.2 方法
            5.2.1 药敏试验
            5.2.2 抗萘啶酸沙门氏菌菌株的选育
            5.2.3 实验动物的饲养管理
            5.2.4 攻毒菌株的准备
            5.2.5 疫苗株的准备
            5.2.6 免疫程序和细菌定殖减少的评价
            5.2.7 样品采集
            5.2.8 粪便样品中疫苗株细菌的计数
            5.2.9 内脏组织中攻毒菌株细菌的计数
            5.2.10 粪便样品中攻毒株细菌的计数
        5.3 结果
            5.3.1 药敏试验结果
            5.3.2 免疫鸡粪便样品中的疫苗株计数结果
            5.3.3 疫苗株χ9241-tHP 诱导的攻毒菌株定殖减少结果
            5.3.4 疫苗株χ9352–tHP 诱导的攻毒菌株定殖减少结果
        5.4 讨论
        5.5 小结
结论
本论文的创新点
参考文献
附录
缩略词
致谢
作者简介



本文编号：3718971