戊型肝炎病毒感染机制初步研究

发布时间：2023-04-28 13:43

　　戊型肝炎病毒(HEV)不稳定易降解,难以从载毒标本中分离,而迄今为止仍没有有效的细胞培养模型,这很大程度上限制了HEV感染致病机制的研究。近年来,随着对HEV研究的深入,较好模拟了HEV病毒衣壳表面结构的重组蛋白为研究HEV与宿主细胞相互作用提供了一条新的途径。 HEV衣壳由单一蛋白(pORF2)组成,大量研究表明pORF2的重组表达片段p239(aa368—606)很好地模拟了HEV的免疫优势中和表位。p239对HEV与原代肝细胞、HepG2细胞的吸附阻断,p239对多株细胞系具有与HEV相似的嗜性,以及多株HEV特异单抗对p239与HepG2细胞结合的特异阻断,强有力地提示p239同时也很好地模拟了HEV与细胞膜的结合所具备的表面结构特征。因此,p239与HepG2细胞的吸附模型是探讨HEV与细胞膜相瓦作用的可靠工具。 不同结合区域的HEV单抗及其Fab片段对p239吸附细胞的阻断结果提示,p239表面至少存在两个细胞受体结合区域:其一为HEV的主要免疫优势中和表位(ORF2 aa459-606),另一个区域为aa423-438。这两个区域均对p239与细胞的特异性吸附有贡献,均能...

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中文摘要
英文摘要(Abstract)
缩略词
前言
    1.病毒入侵过程中与宿主细胞之间的相互作用网络
        1.1.病毒穿膜
        1.2.病毒基因的靶向转运
        1.3.病毒诱导的信号传导
    2.用于研究病毒与宿主蛋白相互作用的方法
        2.1.生物物理学方法
        2.2.分子生物学方法
        2.3.生物信息学方法
    3.戊型肝炎病毒
        3.1.戊型肝炎病毒的流行
        3.2.HEV的生物学特征
        3.3.HEV的细胞培养模型研究进展
        3.4.HEV衣壳蛋白ORF2上中和表位的研究进展
    4.本论文研究的目的与意义
材料与方法
    1.材料
        1.1.主要仪器
        1.2.主要试剂与材料
        1.3.试剂
        1.4.培养基及常用溶液配制
    2.方法
        2.1.基因克隆
        2.2.重组蛋白的表达与纯化
        2.3.蛋白质的透析复性
        2.4.重组蛋白的性质分析方法
        2.5.常规细胞生物学实验方法
        2.6.蛋白与细胞的吸附检测法
        2.7.酵母双杂交实验方法
        2.8.亲合层析操作方法
        2.9.二维电泳操作步骤
        2.10.基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)
        2.11.HepG2细胞中蛋白基因的调取
        2.12.免疫共沉淀
        2.13.计算机辅助设计与分析
第一部分 戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立及病毒吸附区域初步研究
    结果与分析
        1.戊型肝炎病毒细胞吸附模型的建立
            1.1.p239阻断HEV对嗜性细胞的感染
            1.2.p239对多株细胞系的特异性吸附
            1.3.p239对HepG2细胞吸附的特异性
        2.病毒与受体结合区域的初步确定
            2.1.单抗表位的空间位置关系
            2.2.多株单抗对p239吸附HepG2细胞的阻断
            2.3.单抗的Fab段对p239吸附HepG2细胞的阻断
            2.4.线性单抗决定族的定位
            2.5.E2重组蛋白多肽对HepG2细胞的吸附
            2.6.p239蛋白结合位点缺失突变体的构建与鉴定
            2.7.p239及其结合位点突变体△239、233N与HepG2细胞的吸附性
            2.8.p239及其结合位点突变体△239、233N对HEV吸附HepG2细胞的影响
    讨论
        1.p239颗粒-HepG2细胞吸附模型
            1.1.p239具有HEV免疫优势表位
            1.2.p239具有HEV与嗜性细胞结合的关键表位
        2.HEV与宿主细胞的相互作用区域
        3.HEV细胞吸附模型的推测
第二部分 HEV嗜性组织中与HEV衣壳蛋白相互作用蛋白的初步研究
    结果与分析
        1.酵母双杂交筛选人肝细胞cDNA文库中与HEV衣壳蛋白相互作用蛋白
            1.1.构建表达载体BD-E2和AD-E2及酵母表达BD-E2和AD-E2的活性鉴定
            1.2.E2的表达对酵母细胞影响的检测
            1.3.E2相互作用蛋白的筛选
            1.4.生物信息学分析
            1.5.阳性克隆的体外验证
        2.HepG2细胞中与戊型肝炎病毒衣壳蛋白相互作用蛋白的初步研究
            2.1.诱饵蛋白p239-CBP表达后中和表位及颗粒性的鉴定
            2.2.HepG2细胞中与p239-CBP相互作用蛋白的获取
            2.3.猴肝组织中与p239-CBP相互作用蛋白的获取
            2.4.目的蛋白的MALDI-TOF-MS分析
            2.5.生物信息学分析
        3.GRP78/Bip与p239相互作用的进一步验证
            3.1.GRP78/Bip基因的获得及GRP78/Bip的真核表达
            3.2.HEV类病毒颗粒p239与GRP78/Bip体外免疫共沉淀
            3.3.p239与重组Grp78/Bip可直接相互作用
            3.4.GRP78/Bip与p239在细胞内的共定位
        4.HSP90与p239相互作用的验证
            4.1.免疫共沉淀验证HSP90与p239的相互作用
            4.2.HSP90与p239的细胞共定位
    讨论
        1.酵母双杂交方法筛选相互作用蛋白
            1.1.酵母双杂交系统中诱饵蛋白的选择
            1.2.控制酵母双杂交系统高效性,稳定性的一些关键因素
            1.3.对酵母双杂交系统中的阳性与假阳性的认识
        2.亲和层析筛选结合蛋白
        3.2-DE和MALDI-TOF MS分离鉴定蛋白
        4.蛋白相互作用的进一步验证
        5.肝炎病毒与有丝分裂原激活的蛋白激酶信号传导途径(MAPK)
        6.热休克蛋白
            6.1.热休克蛋白70(HSP70)
            6.2.热休克蛋白90(HSP90)
论文小结与展望
参考文献
致谢



本文编号：3803894