肝卵圆细胞移植治疗肝纤维化与肝功能不全的实验研究

发布时间：2023-05-06 16:46

　　目的：建立一种稳定而确实可靠的肝卵圆细胞分离方法,为后续的实验研究奠定基础。 方法：参照Bryon等的报道,利用携带GFP(绿色荧光蛋白)转基因C57BL/6小鼠12只,2只作为空白对照,10只喂以含浓度为0.1%的3,5-二乙酯基-1,4二氢三甲基毗啶(DDC),刺激卵圆细胞的增生。而后利用两步酶灌注法分离出肝非实质细胞,以Sca-1抗体标记的免疫磁珠分选方法加以纯化分离出携带有GFP的SCa-1+细胞。 结果：DDC喂养小鼠6周后,病理切片结果显示肝组织内可见明显的肝卵圆细胞增生反应。分离每只小鼠得可到约106/ml的非肝实质细胞,培养扩增约5d后可见克隆样生长的卵圆细胞,通过Sca-1抗体标记的免疫磁珠分选提纯。电镜下细胞直径10-15μm,呈铺路石样排列,多角形,折光性强,核大,卵圆形,胞浆少,核仁明显。经过鉴定,分离得到的Sca-1+细胞符合卵园细胞的形态学表现,也表达胆管上皮的表面标记OV-6及肝细胞的表面标记AFP,分离纯度达95%以上。 结论：该方法稳定可靠,可为肝卵圆细胞的相关研究提供较为理想的研究手段。 目的：研究肝卵圆细胞在治疗小鼠肝纤维化疾病中的有效性。 方法：...

【文章页数】：129 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
目录
符号说明
前言
第一部分 肝卵圆细胞的分离与体外扩增
    1 材料与方法
        1.1 主要的试剂及药品
        1.2 主要试剂的配制
        1.3 主要的仪器及设备
        1.4 动物的选择及喂养
        1.5 肝脏标本的采集
        1.6 卵圆细胞的分离培养
        1.7 卵圆细胞的纯化
        1.8 卵圆细胞的鉴定
            1.8.1 组织切片
                1.8.1.1 常规石蜡切片的制作
                1.8.1.2 苏木精—伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色
                1.8.1.3 免疫组化染色
            1.8.2 纯化卵圆细胞的进一步鉴定
    2 结果
    3 讨论
    4 结论
第二部分 卵圆细胞经脾脏移植治疗小鼠肝纤维化的实验研究
    1 材料与方法
        1.1 主要的试剂及药品
        1.2 主要试剂的配制
        1.3 主要的仪器及设备
        1.4 动物的选择及喂养
        1.5 肝纤维化模型的建立
        1.6 麻醉及移植方法的建立
        1.7 卵圆细胞治疗实验性肝纤维化的研究
            1.7.1 动物的分组及处理
            1.7.2 标本的采集
            1.7.3 疗效的评价
                1.7.3.1 分别进行以下指标的检测
                1.7.3.2 肝功能指标
                1.7.3.3 肝脏羟脯氨酸(Hyp)含量测定
                1.7.3.4 肝脏胶原纤维含量
                1.7.3.5 肝纤维化病理学分级
                1.7.3.6 移植后卵圆细胞在肝脏内的定居
            1.7.4 数据处理
    2 结果
        2.1 小鼠的一般情况变化
        2.2 肝纤维化的建模情况
        2.3 卵圆细胞的分布情况
        2.4 小鼠肝功能指标的变化
        2.5 肝脏羟脯氨酸和胶原纤维含量的变化
        2.6 病理组织学的分级变化情况
    3 讨论
    4 结论
第三部分 卵圆细胞与骨髓间质干细胞经脾移植治疗实验性小鼠肝纤维化的疗效比较
    1 材料与方法
        1.1 主要的试剂及药品
        1.2 主要试剂的配制
        1.3 主要的仪器及设备
        1.4 动物的选择及喂养
        1.5 肝纤维化模型的建立
        1.6 骨髓间充质干细胞的分离与培养
            1.6.1 骨髓细胞的采集
            1.6.2 密度梯度离心法分离MSC及培养
        1.7 MSC的鉴定
            1.7.1 小鼠MSC表面标记的测定
            1.7.2 体外诱导成骨细胞鉴定
        1.8 麻醉及移植方法的建立
        1.9 HOC与MSC移植治疗实验性肝纤维化的疗效比较
            1.9.1 动物的分组及处理
            1.9.2 标本的采集及疗效的评价
                1.9.2.1 标本的采集
                1.9.2.2 疗效的评价
                    1.9.2.2.1 分别进行以下指标的检测
                    1.9.2.2.2 肝功能指标
                    1.9.2.2.3 肝脏羟脯氨酸(Hyp)含量测定
                    1.9.2.2.4 肝脏胶原纤维含量
                    1.9.2.2.5 肝纤维化病理学分级
            1.9.3 数据处理
    2 结果
        2.1 MSC的鉴定结果
            2.1.1 MSCs的形态学观察
            2.1.2 MSCs的鉴定
        2.2 小鼠的一般情况变化
        2.3 小鼠肝功能指标的变化
        2.4 肝脏羟脯氨酸和胶原纤维含量的变化
        2.5 病理组织学的分级变化情况
    3 讨论
    4 结论
参考文献
综述一 干细胞研究进展
综述二 肝卵圆干细胞研究进展
攻读学位期间公开发表的学术论文及科研课题
致谢



本文编号：3809269