原发性胆汁性肝硬化microRNA表达谱的检测及其功能研究

发布时间：2017-05-31 18:15

  本文关键词：原发性胆汁性肝硬化microRNA表达谱的检测及其功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：原发性胆汁性肝硬化（Primary Biliary Cirrhosis, PBC）是类典型的器官特异性的自身免疫性疾病，以血清中出现高滴度的特异性抗线粒体抗体（Anti-mitochondrialAntibodies,AMAs）、肝内小胆管进行性破坏、胆汁淤积及肝脏门脉周围淋巴细胞浸润等为特征，最终导致肝硬化甚至肝衰竭；尽管也曾报道年轻患者如儿童发生PBC的病例，但PBC仍主要累及50-60岁年龄阶段的女性，男女发病率约为1:10；最近篇最新关于PBC患病率与发病率的系统性回顾发现：PBC的年发病率为0.33-5.8/100,000，而PBC在普通人群中的患病约为1.91-40.2/100,000，且这数据在不断增长中；对于中国的PBC发病率与患病率当前还未有准确的流行病学调查资料，但当前有研究证实在中国非肝炎性慢性肝病中，PBC约占4.6%，由此可见PBC在中国并非十分罕见。 目前认为PBC的发病机制为：遗传因素与环境因素共同作用，引起机体免疫功能紊乱导致淋巴细胞浸润、肝脏汇管区发生炎症反应，在长期炎症刺激下，肝脏发生硬化最终引起肝衰竭；当前研究已证实PBC的特异性自身抗原主要是定位于线粒体内膜上的丙酮酸脱氢酶复合物（PDC）、2-氧戊二酸脱氢酶复合物（OGDC）、侧链二氧酸脱氢酶复合物（BCOADC）的E2亚基，其中在其发病过中发挥主要作用是丙酮酸脱氢酶复合物的E2亚基；虽然人们已经发现这些自身抗原在免疫介导的胆管损害及其他自身免疫性病理反应中具有重要的作用，但对于PBC具体的发病机制目前还未十分清楚。 AMAs作为临床上诊断PBC的特异性自身免疫性抗体，有着较高的敏感度与特异度，其不仅可以用于诊断PBC还可以预测PBC的发生、发展，但是并不是所以的PBC患者血清中均出现高滴度的AMA，有研究发现约5%-10%的PBC患者血清AMA为阴性；此外，血清中的免疫球蛋白（IgM），ANA以及gp210抗体都对PBC的诊断有着重要的辅助作用，但是诊断效能有待提高；而病理诊断是临床诊断PBC病人的金标准，但肝穿刺的高危险性限制其在临床上的广泛开展，PBC的当前的诊断主要限于临床症状与血清学指标。 对于PBC的治疗，临床上仍没有十分有效的方法，熊去氧胆酸是当前经FDA批准的唯类治疗PBC的药物，但是UDCA可以明显改善胆汁淤积的症状，但无法从根本上治疗PBC，也无法阻断疾病的进展；PBC发展到晚期的唯治疗方法就是肝移植，但是临床肝脏器官来源有限及高额的手术费用及术后免疫抑制剂的治疗，临床上肝移植难以在PBC患者中普及应用。 至从人类第次使用原发性胆汁性肝硬化这术语已有50多年，在过去半个多世纪的研究历程中人类也取得了许多成绩，，如AMA的发现、特异性自身抗原的克隆、PBC诊断标准的建立、UDCA治疗作用、GWAS研究等，人们因此也更加清楚的认识了PBC这疾病；但是在人类战胜PBC的研究道路上，仍面临着许多挑战与有待解决的问题如PBC具体的发病机制、更高诊断效能的标志物、以及新的特异性治疗靶点。 microRNAs作为类内源性的短序列非编码的RNA，作用于基因的转录后水平，通过与mRNA的3’端非翻译区的特异性结合以达到翻译抑制或降解mRNA的目的，进而调控机体细胞的增殖、分化、凋亡等系列物学活动。近来研究发现在自身免疫性疾病中microRNA的表达谱存在异常表达，如已发现在SLE患者PBMC中存在16个microRNA异常，而狼疮肾炎组织中有66个microRNA的表达有异常,这些结果提示microRNA的异常可能与自身免疫性疾病的发病机制有着重要关系。除了在SLE中发现异常表达的microRNA,在其它自身免疫性疾病如在类风性关节炎、多发性硬化、溃疡性结肠炎、银屑病等疾病的外周血或病变组织中均发现存在相应的microRNA异常，如microRNA-146、microRNA-155、microRNA-326等与机体免疫功能相关的microRNAs；但是当前对于PBC的microRNA表达谱以及microRNA在PBC发病机制中的作用还未十分清楚，因此，本研究旨在探索PBC患者中microRNA表达谱的异常及其在PBC发病机制中的作用。 第一部分PBC患者外周血单个核细胞中异常microRNA的检测 在此部分研究中，我们首先用microRNA芯片筛选出PBC病人与健康志愿者外周血单个核细胞中异常的microRNA表达谱，芯片结果显示与健康正常组相比PBC患者的PBMCs中共有17个异常表达的microRNAs，其中11个表达上调，6个表达下调；随后我们选择其中异常表达的6个microRNAs(miR-15a-5p,miR-20a-5p, miR-140-3p, miR-106b-5p, miR-3654, miR-181a-5p)在9例健康对照组与9例PBC患者组的PBMCs中进行RT-PCR验证，结果与芯片结果保持致，从而说明microRNA表达谱芯片结果的可靠性；该部分研究结果说明PBC患者PBMCs中确实存在有异常表达的microRNA。 第二部分异常表达的microRNA的功能分析 通过第部分我们得到在PBC中异常表达的17个microRNA，随后我们进行了相关的生物信息学分析；首先，对异常表达的microRNA的靶基因的预测，分别通过搜索miRDB数据库、TargetScan数据库预测差异microRNA调控的所有靶点，对靶基因进行组织特异性筛选，得到特异表达于外周血中的靶基因；随后对靶基因进行GO分析得到靶基因参与的显著靶向性功能，发现上调microRNA主要调控的功能有信号传导、细胞分化、凋亡等功能，而下调的microRNA主要的调控功能有信号传导、离子转运、染色体修饰、细胞增殖等功能；同样为了进步阐明异常表达的microRNA参与的信号通路，我们进行了pathway分析，发现这些异常表达的microRNA与主要影响细胞内吞作用、MAPK信号通路、TGF-β信号通路以及Wnt信号通路、钙离子信号通路等；随后，根据GO功能分析及Pathway显著性分析，得到显著性GO及Pathway所属靶基因，利用这些靶基因与microRNA的靶向调控关系，构建microRNA-Gene-Work进步显示二者之间靶向关系；该部分研究结果显示这些异常microRNA参与了许多细胞功能与信号通路的调控，而这些信号通路与细胞功能也被研究证实在PBC的发病中有着重要的作用。 第三部分microRNA-106b-5p靶点的验证 在此部分研究中，基于第部分得到的17个异常表达的microRNA，我们选择microRNA-106b-5p做进步的靶点探索；首先，我们在原发性胆汁性肝硬化、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征以及病毒性肝炎肝硬化患者中检验PBMCs中microRNA-106b-5p的表达水平，发现在PBC患者中microRNA-106b-5p表达显著升高（P0.05）；随后我们选择THp1细胞用于microRNA-106b-5p靶点研究中，，RT-PCR及Western blot结果均显示转染mimic及inhibitor后JAK1水平发生相应的改变，此外，荧光素酶报告基因载体也证实了二者的靶向作用关系；该部分研究结果说明microRNA-106b-5p可以靶向作用于JAK1，调控其表达水平。 综上所述，本研究发现了PBC患者异常表达的microRNA表达谱并探索了其在PBC发病机制中的功能作用，microRNA-106b-5p作为类上调表达的microRNA可以靶向作用于JAK1调控其表达；此外，这些异常的microRNA可以进步解释PBC的发病机制并可能成为新的疾病标记物及治疗靶点。
【关键词】：microRNA 原发性胆汁性肝硬化 microRNA-106b-5p JAK1
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 中英文缩略词12-13
• 第一部分 PBC患者外周血单个核细胞中microRNA芯片检测及RT-PCR验证13-23
• 一、材料与方法13-18
• 二、实验结果18-21
• 讨论21-23
• 第二部分 异常表达microRNA的靶点预测及功能分析23-34
• 一、材料与方法23-25
• 二、结果25-31
• 讨论31-34
• 第三部分 microRNA-106b-5p靶点的验证34-49
• 一、实验材料与方法34-42
• 二、实验结果42-48
• 讨论48-49
• 参考文献49-52
• 全文总结52-53
• 综述53-64
• 参考文献58-64
• 研究生期间发表论文64-65
• 致谢65-66

【共引文献】

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1 梁雪艺;周刚;;微核糖核酸在自身免疫性疾病和口腔癌前病变中作用的研究进展[J];国际口腔医学杂志;2013年03期

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3 齐利枝;生冉;闫素梅;赵艳丽;;乙酸浓度对奶牛乳腺上皮细胞甘油三酯含量及瘦素和过氧化物酶增殖物激活受体γ基因表达量的影响[J];动物营养学报;2013年07期

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7 郑旭青;代天星;林晓敏;熊浩;杨海弟;;KCNJ10通道蛋白在C57BL/6J小鼠耳蜗的年龄相关性表达及与听力关系[J];中国耳鼻咽喉头颈外科;2013年08期

8 文惠方;蒋春梅;张尚弟;车团结;黄超杰;赵峰;;宫腔脱落细胞中p53、ki-67、bcl-2、bax基因的表达及意义[J];中国妇产科临床杂志;2013年05期

9 孙敏敏;刘含亮;王红卫;孟晓;王纪亭;万文菊;;酵母铬对尼罗罗非鱼生长和糖代谢的影响[J];动物营养学报;2013年09期

10 朱铁锤;;NLRP3在马兜铃酸致肾损伤小鼠肾脏组织中的表达及其意义[J];吉林大学学报(医学版);2013年05期

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1 赵海霞;Ying Li;Yuzhong Wang;Jing Zhang;Xiaoming Ouyang;Renxiu Peng;Jing Yang;;蜈蚣糖肽抗肿瘤和免疫调节活性的研究(英文)[A];第十一届全国博士生学术年会（生物医药专题）论文集（上册，大会报告）[C];2013年

2 王志刚;严志;章必成;饶智国;余丽芳;刘健;高建飞;;基于芯片数据的随机森林算法鉴定结肠癌生物标记物(英文)[A];第四届湖北省抗癌协会青年委员会学术交流会论文集[C];2012年

3 Ruiwen Fan;Shanshan Yang;Zhanquan Shi;Kaiyuan Ji;Xiaoyun Jia;Jianbo Yao;George W Smith;Changsheng Dong;;Identification of a novel miRNA important for melanogenesis in alpaca(Lama Pacos)[A];2013中国驼业进展[C];2013年

4 郭翔羽;刘璇;徐仙洲;吴蒙;张旭;李强;刘文娇;张毅;王雅春;俞英;;牛DNA甲基转移酶3a/3b基因(DNMT3a/3b)的表达对肉质性状的影响[A];《第八届中国牛业发展大会》论文集[C];2013年

5 王晓珂;赵健亚;刘天娥;陈致飞;张璇;王春;陈刚;;白藜芦醇对高脂膳食诱导的肥胖易感和肥胖抵抗大鼠体重的影响及相关机制[A];2013中国环境科学学会学术年会论文集（第七卷）[C];2013年

6 Tiantian Liu;Yanling Zhao;SiSi Wei;Jiabo Wang;Lei Jia;Ping Zhang;Shuxian Liu;Yun Zhu;Ruisheng Li;Ruilin Wang;Jianyu Li;Yonggang Li;Xiaohe Xiao;;Large Dose Means Significant Effect?-Investigation of the hepatoprotective effects and dose-effect relationship of Chi-Dan-Tui-Huang decoction on alpha-naphthylisothiocyanate-induced acute cholestatic hepatitis in rats[A];中国医药教育论坛-中国医药教育协会第三届三次理事大会暨学术年会论文专辑[C];2013年

7 Huang Qiang;Gong Yuehua;Wei Anqing;Peng Xiaoling;;Effects of hBD-3 on Staphylococcus aureus biofilm formation-regulating genes dltB and icaA genes[A];江西省第八次中西医结合危重病、急救医学学术研讨会论文集[C];2013年

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8 王宇;系统性红斑狼疮CD4+T细胞microRNA表达谱研究[D];中南大学;2010年

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10 谢凤燕;丹酚酸B阻止TGF-β1诱导的HK-2细胞转分化以及相关microRNA的变化[D];南京医科大学;2012年

  本文关键词：原发性胆汁性肝硬化microRNA表达谱的检测及其功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：410274