黏蛋白Core 2 O-型糖链的机制研究

发布时间：2017-06-23 10:19

  本文关键词：黏蛋白Core 2 O-型糖链的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景＆目的 肠黏液屏障作为机体抵御外界损害的天然屏障，其粘液主要由黏蛋白组成，而黏蛋白中绝大部分分子质量是由O-型糖链(少量N-型糖链)组成，因此黏蛋白中的O-型糖链与其功能密切相关，有研究表明，某些O-型糖链是作为一些细菌表面的黏附素连接碳水化合物的配体；黏蛋白O-型糖基化的改变将伴随肿瘤的发生和调节肿瘤的生长、粘附、侵袭、转移，然而黏蛋白O-型糖链在调节细胞生物学行为方面和肠道致病菌与肠上皮细胞相互作用机制方面尚不清楚。 O-型糖链根据不同连接在丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸分子上的单糖分子及其糖化模式的不同可以主要区分为Core1，Core2，Core3和Core4四种不同的O-型糖链，而Core2O-型糖链主要表达于胃和结肠，因此我们通过benzyl-α-GalNAc抑制O-型糖链的合成来探讨其参与大肠杆菌（EPEC和EHEC O157:H7）对肠上皮细胞侵袭的影响；对Core2O-型糖链合成酶（C2GnT-2）用RNA干扰技术抑制其表达，进而探讨其参与大肠杆菌（EPEC和EHEC O157:H7）对肠上皮细胞侵袭的分子机制和生物学行为改变的影响，从而揭示黏蛋白O-型糖基化及其Core2型糖链参与大肠杆菌（EPEC和EHEC O157:H7）对肠上皮细胞侵袭的影响，以及对肠上皮细胞生物学行为的影响。 方法 1. HT-29细胞培养及促分化细胞（HT-29-Gal）模型的建立。 2. O-型糖链抑制剂（benzyl-N-acetyl-α-D-galactosaminide，benzyl-α-GalNAc）处理HT-29细胞和HT-29-Gal细胞,获得HT-29-Obn细胞和HT-29-Gal-Obn细胞。 3.细胞免疫荧光检测HT-29、HT-29-Gal、HT-29-Obn和HT-29-Gal-obn细胞中凝集素的变化。 4. HT-29、HT-29-Gal、HT-29-Obn和HT-29-Gal-obn细胞分别与EPEC和EHECO157:H7共孵育2h，PBS清洗去除未粘附的细菌，再加入庆大霉素（100ug/ml）培养2h，杀灭粘附于细胞表面的细菌，再加入0.25%胰酶和0.025%Triton X100裂解细胞，释放出细胞内细菌，最后采用系列稀释裂解液琼脂板克隆计数观察侵袭入细胞内细菌数目。 5. qRT-PCR和Western blotting检测HT-29、shRNA-Ctr/HT-29和shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞中C2GnT-2干扰效率。 6．电阻测定仪检测shRNA-Ctr/HT-29细胞和shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞在EPEC或EHEC O157:H7感染或未感染下电阻的变化情况及免疫荧光染色紧密链接蛋白（ZO-1和Occludin）的变化情况。 7. ELISA检测shRNA-Ctr/HT-29细胞和shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞在EPEC或EHEC O157:H7感染或未感染下IL-6或IL-8的变化情况。 8.免疫细胞化学染色检测HT-29、shRNA-Ctr/HT-29和shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞凝集素的变化情况。 9．MTT实验、细胞划痕实验、细胞侵袭实验检测C2GnT-2干扰质粒转染HT-29细胞后，细胞生物学行为的改变。 10. Western blotting检测C2GnT-2干扰质粒转染HT-29细胞后，细胞链接蛋白ZO-1、Occludin、E-cadherin和凋亡蛋白Caspase-3的变化情况。 结果 1.凝集素组织化学染色HT-29、HT-29-Gal、HT-29-Obn和HT-29-Gal-obn细胞中凝集素显示，7种凝集素在HT-29-Obn和HT-29两种细胞中的表达量和形态学上的变化是相近的；HT-29-Gal-obn细胞与HT-29-Gal细胞比较，HT-29-Gal-obn细胞MAA表达量明显减少，PNA、GSAII表达量明显增加，而SNA、DBA、UEA-I、ConA无明显变化；HT-29-Gal细胞与HT-29细胞比较，HT-29-Gal细胞GSAII表达量明显减少。 2. HT-29、HT-29-Gal、HT-29-Obn和HT-29-Gal-obn细胞裂解液系列稀释琼脂板克隆计数显示，侵袭入HT-29-Obn细胞和HT-29-Gal-obn细胞中的EPEC和EHECO157:H7均高于对照的HT-29细胞和HT-29-Gal细胞，（P0.05）。 3. qRT-PCR和Western blotting检测HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞中C2GnT-2表达显示，shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞C2GnT-2的蛋白、mRNA表达量均明显低于HT-29细胞和shRNA-Ctr/HT-29细胞。 4.组织化学染色HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞凝集素显示，shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞与HT-29细胞和shRNA-Ctr/HT-29细胞相比较，shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞中MAA表达量有所减少、SNA表达量有所增加。 5.在EPEC或EHEC O157:H7感染下，电阻抗测定shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞中电阻变化显示，shRNA-Ctr/HT-29细胞和shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞电阻抗值均下降，但shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞电阻下降值明显高于shRNA-Ctr/HT-29细胞（P0.05）。 6.在EPEC或EHEC O157:H7感染下，免疫荧光检测HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞紧密链接蛋白（ZO-1和Occludin）显示，shRNA-Ctr/HT-29细胞和shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞相比较，ZO-1的表达量、分布连续性上无明显差异；Occludin在shRNA-C2GnT-2/HT-29和shRNA-Ctr/HT-29细胞中均出现颗粒样聚集，并在细胞膜的表达出现不连续性，即断裂现象，但Occludin在表达量上无明显差异。 7.在EPEC或EHEC O157:H7感染下，ELISA检测shRNA-Ctr/HT-29和shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞中IL-6和IL-8显示， shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞和shRNA-Ctr/HT-29细胞中均未检测到炎症因子IL-6和IL-8的表达。 8. MTT、细胞划痕、细胞侵袭实验检测HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞生物学行为显示，shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞增值能力、生长速度、侵袭能力均高于HT-29细胞和shRNA-Ctr/HT-29细胞（P0.05）。 9. Western blotting检测HT-29、shRNA-Ctr/HT-29、shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞中链接蛋白（ZO-1,Occludin,E-cadherin）和凋亡蛋白（Caspase-3）显示：shRNA-C2GnT-2/HT-29细胞细胞链接蛋白ZO-1,Occludin,E-cadherin和凋亡蛋白Caspase-3的表达量与HT-29细胞和shRNA-Ctr/HT-29细胞相比，，无明显变化。 结论 1.抑制肠上皮细胞黏蛋白O-型糖链的合成导致细胞糖基化模式的改变。 2.抑制肠上皮细胞黏蛋白O-型糖链的合成导致侵袭入细胞内的细菌增加。 3.干扰肠上皮细胞Core2O-型糖链的合成导致细菌侵袭增加，主要是通过改变肠上皮细胞屏障功能所致。 4.在干扰Core2O-型糖链合成的肠上皮细胞和对照细胞中，Occludin在细菌作用下，均出现颗粒样聚集，并在细胞膜的表达出现不连续性，即断裂现象。 5.干扰肠上皮细胞C2GnT-2的合成导致其生长、迁移、侵袭能力均增加。
【关键词】：O-型糖链 benzyl-α-GalNAc Core 2 C2GnT-2
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R57
【目录】：

• 缩略语表4-6
• Abstract6-10
• 摘要10-13
• 第一章 前言13-15
• 第二章 黏蛋白 Core 2 O-型糖链影响细菌侵袭肠上皮细胞的研究15-35
• 2.1 材料15-17
• 2.2 方法17-24
• 2.3 结果24-33
• 2.4 讨论33-35
• 第三章 C2GnT-2 影响结肠腺癌细胞生物学行为的改变35-44
• 3.1 材料35-36
• 3.2 方法36-37
• 3.3 结果37-41
• 3.4 讨论41-44
• 全文总结44-45
• 参考文献45-48
• 文献综述48-56
• 参考文献53-56
• 在读期间发表的论文56-57
• 致谢57

【参考文献】

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1 刘韵;叶钧;宋丽丽;田音;潘琼;彭志红;汪荣泉;;Core 2和Core 4 O-型糖链参与大肠杆菌对肠上皮细胞的黏附与侵袭[J];第三军医大学学报;2014年02期

  本文关键词：黏蛋白Core 2 O-型糖链的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：474746