抗TNF-α抗体对DSS结肠炎小鼠肠黏膜通透性的影响及机制研究

发布时间：2017-07-03 12:27

  本文关键词：抗TNF-α抗体对DSS结肠炎小鼠肠黏膜通透性的影响及机制研究

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【摘要】：背景肠黏膜屏障在预防微生物及毒素由肠腔侵入机体方面发挥重要作用。在炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）过程中，肠道屏障功能显著受损，菌群失调，大量内毒素和（或）病原微生物等经受损肠黏膜进入体循环，通过多种机制增加肠通透性，诱发和(或)加重肠道炎症和免疫反应，研究表明提出肠黏膜屏障破坏可能是IBD发病机制的启动环节，修复肠黏膜屏障有利于控制或减轻肠黏膜炎症和免疫反应，改善肠黏膜通透性，，是治疗IBD的重要方法之一。肠黏膜屏障主要包括肠上皮细胞(intestinal epithelial cell，IEC)和紧密连接(tight junction，TJ)，通过肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK）激活，调控肌球蛋白轻链(MLC)收缩，相邻肠上皮细胞间隙增大，肠黏膜通透性增加，前炎性细胞因子如TNF-α增加MLC磷酸酶转录和激活MLCK活性，增加肠黏膜通透性。目前部分抗结肠炎药物可通过各种机制调控MLCK，影响肠上皮细胞紧密连接结构和功能，抗TNF-α抗体作为生物制剂，在IBD的临床治疗中具有重要影响，抗TNF-α抗体治疗可以降低CD患者肠黏膜通透性，修复肠黏膜屏障功能，是IBD生物治疗的重要机制，目前尚未见到有关抗TNF抗体能否影响UC肠黏膜通透性，以及是否通过MLCK调控肠黏膜通透性的研究。 目的用C57BL/6J小鼠建立葡聚糖硫酸钠(dextransulfatesodium，DSS)结肠炎模型，研究抗TNF-α抗体对DSS结肠炎小鼠肠黏膜通透性的影响及作用机制。 方法C57BL/6J小鼠自由饮用5％DSS溶液1周制备结肠炎模型，实验分成正常对照组、DSS模型对照组、抗TNF-α抗体给药组。抗TNF-α抗体（5mg/kg）腹腔注射给药，每周两次，正常对照组和DSS模型组用等量生理盐水腹腔注射给药，给药时间共7天。每日进行DAI评分，实验结束后取结肠进行HE染色评分，结肠黏膜匀浆检测髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性及TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平，小肠黏膜透射电镜检查，采用EB和FITC-dextran方法检测小肠黏膜通透性，另取小鼠小肠黏膜进行肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)活性测定、免疫组化及Western blot检测。 结果与正常对照组比较，模型对照组小鼠出现明显体重减轻、便血和腹泻，DAI评分和HI评分增高(P0.01)，结肠黏膜匀浆中MPO活性和TNF-α、IFN-γ、IL-13和IL-17水平增高（P0.01）；电镜检查小鼠回肠黏膜上皮绒毛萎缩、排列不规则，细胞间连接复合体缩短、变宽，细胞间隙扩大，小肠黏膜通透性增高；小鼠小肠黏膜中MLCK活性明显增高（P0.05），Western blot检测显示小鼠小肠黏膜MLCK表达明显增加。与模型对照组比较，抗TNF-α抗体组小鼠DAI评分和HI评分明显降低（P0.01），结肠黏膜匀浆中MPO活性和TNF-α水平降低（P0.01）；电镜检查小鼠回肠黏膜上皮细胞形态结构改善，绒毛排列整齐，小肠黏膜通透性降低；小鼠小肠黏膜中MLCK活性和表达明显降低（P0.01）。 结论抗TNF-α抗体具有显著的抗结肠炎作用，机制可能与通过调控MLCK表达改善肠黏膜通透性有关。
【关键词】：抗TNF-α抗体 结肠炎 肠黏膜通透性 肌球蛋白轻链激酶
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R574.62
【目录】：

• 英文缩略词表7-8
• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-12
• 2 材料和方法12-20
• 2.1 材料12-15
• 2.1.1 动物12
• 2.1.2 药品与试剂12-14
• 2.1.3 仪器14-15
• 2.2 方法15-20
• 2.2.1 结肠炎动物模型的建立15
• 2.2.2 实验分组和抗TNF-α给药方法15
• 2.2.3 检测方法15-20
• 2.2.3.1 疾病活动指数评分15-16
• 2.2.3.2 结肠组织的大体观察和病理检查16-17
• 2.2.3.3 结肠匀浆 MPO 水平检测17-18
• 2.2.3.4 结肠匀浆 TNF-α、IFN-γ、IL-13 和 IL-17 水平检测18-19
• 2.2.3.5 小肠黏膜电镜检查19
• 2.2.3.6 小肠黏膜肠通透性检测19
• 2.2.3.7 小肠黏膜 MLCK 蛋白活性测定19-20
• 2.2.3.8 小肠黏膜 MLCK 蛋白免疫组化20
• 2.2.3.5 小肠黏膜 MLCK 蛋白免疫印迹测定20
• 2.3 数据及统计分析20
• 3 结果20-28
• 3.1 抗TNF-α抗体抗结肠炎的药效学20-25
• 3.1.1 一般状况20-21
• 3.1.2 结肠组织的大体观察21-22
• 3.1.3 结肠组织的病理观察22-23
• 3.1.4 结肠组织匀浆 MPO 活性23-24
• 3.1.5 结肠组织匀浆炎性细胞因子水平24-25
• 3.2 抗TNF-α抗体对结肠炎小鼠肠黏膜屏障的影响25-26
• 3.2.1 小肠黏膜超微结构变化25
• 3.2.2 小肠黏膜通透性变化25-26
• 3.3 抗 TNF-α抗体对结肠炎小鼠肠黏膜 MLCK 表达的影响26-28
• 3.3.1 小肠黏膜 MLCK 活性的影响26-27
• 3.3.2 免疫组化检测小肠黏膜 MLCK 表达27
• 3.3.3 免疫印记法检测小肠黏膜 MLCK 表达27-28
• 4 讨论28-32
• 5 结论32-33
• 参考文献33-41
• 附录41-42
• 致谢42-43
• 综述43-49
• 参考文献46-49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 宋红丽,吕飒,马力,李颖,刘沛;TNF-α影响肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白的表达[J];世界华人消化杂志;2004年06期

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3 杜学良,孙瑛,栾竞,储毅,陈莉,郭恒怡,吴其夏;肿瘤坏死因子增强培养的血管内皮细胞与血小板粘附及其机制[J];中国病理生理杂志;1997年05期

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5 朱峰;钱家鸣;潘国宗;;细胞免疫反应性炎症性肠病动物模型的建立[J];中国医学科学院学报;1998年04期

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本文编号：513694