IRF3通过AKT通路对调控TGF-β1诱导的肝星状细胞活化增殖作用研究

发布时间：2017-07-18 08:36

  本文关键词：IRF3通过AKT通路对调控TGF-β1诱导的肝星状细胞活化增殖作用研究

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【摘要】：肝纤维化是应对慢性肝脏损伤的愈合过程,其发病的主要特征是肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)分泌的以胶原Ⅰ和胶原Ⅲ为主要成分的细胞外基质(extracellur matrix, ECM)在肝脏内的过量沉积。因此,肝星状细胞的活化被公认为是肝纤维化发生的中心事件,而抑制HSC增殖有助于肝纤维化的逆转。干扰素转录因子3(IRF3)是干扰素转录因子家族中的成员之一,在人体天然免疫中扮演着重要角色。近年来研究表明IRF3在调控肝脏疾病中,如肝脂肪变性,肝脏炎症和酒精肝损伤等中起着重要作用,然而IRF3在肝纤维化中的调控作用,尤其是对HSC的活化及增殖相关作用还未见报道。本实验重点研究了IRF3在HSC活化过程中及人纤维化肝组织中的表达情况,并深入探讨IRF3对HSC增殖的影响及其调控机制研究内容主要包括以下几个部分：1.IRF3在人肝纤维化组织中的表达人肝纤维化组织由从安徽省立医院和安徽医科大学第一附属医院肝胆外科进行外科手术的患者中获得,根据日本权威癌症组织的说明,一般癌旁组织2cm处判定为肝纤维化组织。实验用免疫组化,蛋白免疫印迹术和实时定量PCR检测IRF3在肝纤维化组织中的表达。实验结果表明,相较于正常肝组织,IRF3蛋白和mRNA的表达水平在纤维化组织中的表达量明显上升。同时我们也运用免疫荧光双染的方法定位IRF3在肝组织中的表达。结果发现,IRF3可以与α-SMA在肝纤维化组织中共表达,提示肝星状细胞是肝脏内表达α-SMA的主要细胞类型之一。2.IRF3对活化的LX-2细胞的影响为了观察IRF3对星状细胞活化增殖的影响,实验以LX-2为研究对象,检测了人的肝形状细胞系LX-2中IRF3的蛋白和mRNA表达。结果发现,用不同浓度的TGF-β1(从0 ng/ml到10 ng/ml)刺激LX-2细胞24 h后,IRF3的表达量显著上调且呈现剂量依懒性。用10 ng/ml TGF-β1刺激LX-2细胞6h、12h、24h、48 h IRF3的表达情况,结果发现TGF-β1刺激LX-2细胞时间越长,IRF3的表达量越高,呈现出时间依懒性。为了探究了IRF3对LX-2分泌细胞外基质及纤维化指标α-SMA蛋白的影响,实验用siRNA-IRF3转入LX-2细胞中用以降低IRF3的表达,Western Blot和Real time qPCR发现,与对照组相比,沉默IRF3后α-SMA和Collal表达量明显降低；而转染质粒pcDNA3-IRF3过表达IRF3后,α-SMA和Collal表达量显著上调。3.IRF3通过激活AKT信号通路调节LX-2细胞凋亡和增殖为了探究IRF3对LX-2的增殖和凋亡作用,实验采用了MTT实验和流式细胞术。MTT结果表明,在TGF-β1刺激24 h后,与对照组相比,转染siRNA-IRF3后能够明显抑制LX-2细胞的增殖。流式凋亡结果发现,相较于对照组,转染siRNA-IRF3后LX-2细胞凋亡比例明显增加。此外,实验发现沉默IRF3后可以降低LX-2细胞中p-AKT的表达,提示IRF3可能通过正调控AKT信号通路影响LX-2细胞的凋亡及增值。
【关键词】：IRF3 肝星状细胞 AKT信号通路 肝纤维化
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 英文缩略词6-8
• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 1. 前言13-14
• 2. 实验材料14-17
• 2.1 肝组织材14
• 2.2 药品与试剂14-15
• 2.3 抗体15
• 2.4 仪器与设备15-16
• 2.5 基因序列16-17
• 3. 实验方法17-27
• 3.1 肝星状细胞LX-2的培养17
• 3.2 人体肝组织病理HE染色17-18
• 3.3 人体肝组织病理Masson染色及其判定18
• 3.4 免疫组织化学测定18-19
• 3.5 RNAi干扰实验19
• 3.6 IRF3质粒提取及转染19-21
• 3.7 Western Blot21-24
• 3.8 实时荧光定量PCR24-26
• 3.9 细胞凋亡检测（Annexin V-FITC/PI双染法）26
• 3.10 实验结果数据分析26-27
• 4. 实验结果27-42
• 4.1 IRF3在人体纤维化组织中表达变化27-30
• 4.2 IRF3在TGF-β1诱导的LX-2细胞中的表达变化30-33
• 4.3 IRF3对肝纤维化的调控作用33-36
• 4.4 IRF3对LX-2细胞增殖及凋亡的影响36-37
• 4.5 IRF3对LX-2细胞中凋亡相关蛋白表达的影响37-39
• 4.6 IRF3在LX-2细胞中对AKT信号通路的调控作用39-42
• 5. 讨论42-44
• 6. 结论44-45
• 参考文献45-48
• 附录48-50
• 致谢50-51
• 综述51-59
• 参考文献56-59
• 学员须知59

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本文编号：556894