HBV前S2蛋白对信号分子LPA的影响及LPA对胰岛素分泌的作用

发布时间：2017-07-29 03:20

  本文关键词：HBV前S2蛋白对信号分子LPA的影响及LPA对胰岛素分泌的作用

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【摘要】：目的研究HBV pre-S2的表达与细胞核内定位,pre-S2对水解性溶血磷脂酸(LPA)的溶血磷脂酶A1(LYPLA-1)启动子的反式激活作用,以及外源性LPA对胰岛素分泌的影响,为进一步研究乙型肝炎并发糖尿病的发病机制提供研究线索与实验依据。方法1.HBV pre-S2的表达与细胞核内定位(1)HBV pre-S2和绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建:从乙肝患者血清中提取HBV DNA,设计带HindⅢ、EcoRⅠ酶切位点的特异性引物扩增HBV pre-S2基因,胶回收后克隆入T-easy载体构建pGEM-HBV-S2。HindⅢ、EcoRⅠ双酶切pGEM-HBV-S2和pcDNA3.1-EGFP,分别胶回收pre-S2基因片段及酶切后的pcDNA3.1(+)-EGFP质粒,连接后转化大肠杆菌DH5α以获得pcDNA3.1-PreS2-EGFP。(2)pre-S2在细胞核内的表达:pcDNA3.1-PreS2-EGFP转染HepG2细胞48h后,经4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染色细胞核,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。2.pre-S2对LYPLA-1启动子的反式激活作用应用LYPLA-1启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-LYPLA-1和pre-S2真核表达质粒pcDNA3.1(-)-pre-S2共转染HepG2,然后通过检测细胞荧光素酶活性来评价pre-S2对LYPLA-1基因启动子的作用。3.外源性LPA对胰岛素分泌的影响(1)小鼠胰岛细胞的分离纯化:首先通过胆总管逆行灌注胶原酶Ⅴ溶液进行小鼠胰腺消化,分离胰岛,然后采用不连续密度梯度Ficoll离心法纯化胰岛细胞。(2)外源性LPA对胰岛细胞胰岛素分泌的影响:以0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、3μmol/L、4μmol/L和5μmol/L浓度LPA刺激原代培养的胰岛细胞和分泌胰岛素细胞MIN6,以培养液总蛋白浓度校正胰岛素分泌量测定胰岛素浓度。结果重组载体pcDNA3.1-PreS2-EGFP测序结果证实其包含HBV pre-S2基因序列,经亚克隆后酶切及测序均证实构建的重组载体与设计一致。荧光显微镜观察结果显示,pEGFP-preS2转染后可介导pre-S2-EGFP融合蛋白表达且绿色荧光明显集中在细胞核内。HBV pre-S2激活LYPLA-1基因启动子。外援性LPA在0-3μmol/L浓度范围内促进细胞的胰岛素分泌。结论HBV pre-S2可定位于细胞核并激活能水解LPA的LYPLA-1基因启动子,外源性LPA影响胰岛细胞和MIN6细胞的胰岛素分泌,在0-3μmol/L浓度范围内促进细胞的胰岛素分泌。
【关键词】：HBV前S2蛋白 溶血磷脂酸 胰岛素分泌
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.1;R512.62
【目录】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 英汉缩略词表9-11
• 前言11-13
• 1 材料与方法13-19
• 1.1 实验材料、试剂及仪器13-15
• 1.2 实验方法15-19
• 2 结果19-25
• 2.1 HBV前S2蛋白绿色荧光蛋白融合基因表达载体的构建19-21
• 2.2 HBV前S2蛋白核定位研究21-22
• 2.3 HBV前S2蛋白的反式激活溶血磷脂酶A1启动子的研究22-23
• 2.4 小鼠胰岛细胞的分离23-24
• 2.5 外源性溶血磷脂酸对葡萄糖诱导胰岛素分泌的影响24-25
• 3 讨论25-27
• 4 结论27-28
• 参考文献28-32
• 综述32-42
• 参考文献38-42
• 攻读学位期间发表的学术论文目录42-43
• 致谢43-44

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本文编号：587287