高通量测序技术用于丙型肝炎病毒感染溯源调查

发布时间：2017-07-30 04:22

  本文关键词：高通量测序技术用于丙型肝炎病毒感染溯源调查

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【摘要】：背景近年来我国的丙型肝炎聚集性疫情暴发事件时有发生。为了调查疫情暴发的源头、追踪传播关系,有针对性地制定预防控制方案,需要可靠的丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)感染溯源实验室检测数据提供支持。国外报道用于HCV感染溯源调查的实验室技术主要有巢式PCR产物直接测序法、PCR产物克隆测序法和终点有限稀释PCR产物测序法,其中巢式PCR产物直接测序法国内也有报道。巢式PCR产物直接测序法操作简便,但获得的信息量少,只能获得优势准种的核酸序列；而后两种方法可用于在准种水平上分析HCV感染者之间的传播关系,不足之处是操作比较繁琐、工作量大。第二代测序技术(Next-generation sequencing technology. NGS)的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis),即通过识别新合成的序列末端的标识来确定DNA的序列,一次检测可以获得大量的核酸信息。目前应用较多的技术平台主要包括Illumina/Solexa Genome Analyzer(美国Illumina公司)、Applied Biosystems SOLID system (美国ABI公司)和Roche 454 FLX焦磷酸测序平台(美国454 Life Sciences公司)。其中Roche 454 FLX焦磷酸测序平台曾被用于未经过HCV抗病毒治疗的感染者病毒准种的变异性、HCV抗病毒治疗患者准种的变异性、HCV急性感染者病毒进化的瓶颈效应、HCV暴发调查等的研究中,但它因测序成本很高,用于HCV感染溯源调查的实用价值不大。本课题组曾将美国Illumina公司的Miseq高通量测序平台成功地用于肾透析人群HCV的传播关系调查。本研究拟利用美国Illumina公司开发、通量更高的Hiseq高通量测序平台(简称Hiseq测序),建立基于准种分析的HCV感染溯源技术,并尝试用于静脉注射吸毒人群中HCV的传播关系调查,为今后应对丙型肝炎聚集性疫情暴发调查提供技术储备。目的1.建立并优化基于HCV准种分析的Hiseq测序技术；2.了解静脉注射吸毒人群中HCV感染者体内HCV准种的分布规律；3.探索Hiseq测序技术在HCV感染溯源调查中的应用。材料和方法1.研究对象1.1一例新近HCV感染者的溯源调查针对1例2015年1月15日在美沙酮门诊发现的HCV抗体阳转静脉注射吸毒者(编号P1),调查在其可能感染HCV的时期内(2014年3月24日之后)与其共用针具、HCV抗体阳性的4例静脉注射吸毒者(编号P2-P5)的流行病学信息,并以与P1在同一美沙酮门诊服药或者居住在同一乡镇、HCV抗体阳性的28例静脉注射吸毒者(编号C1-C28)作为研究对照。分别采集上述33人的全血样品5 m1,离心后分离出血浆备用。1.2两个美沙酮门诊静脉注射吸毒HCV感染者间的传播关系研究针对2个美沙酮门诊H和L,收集2015年1-9月发现的所有静脉注射吸毒HCV抗体阳性者的血浆样品备用(编号分别为H1-H13、L1～L32)。2.实验方法2.1从血浆样品中提取RNA,然后逆转录合成cDNA。2.2 PCR产物直接测序：分别对NS5B基因区和Core/E1基因区进行PCR扩增,产物直接测序；根据序列结果对HCV样品进行基因亚型分析。2.3针对HCV HVR1区设计引物、优化反应条件。引物尽可能覆盖多种基因亚型,必要时设计多套引物。2.4针对HCV HVR1区,对cDNA进行PCR扩增；PCR产物纯化后,构建DNA文库,然后进行Hiseq测序。2.5 Hiseq测序数据初步处理后,统计每条独特序列出现的频数,了解HCV准种群分布情况；剔除重复序列后,获得每个样品的多个独特准种群序列,进行系统进化分析。结果1.一例新近HCV感染者的溯源调查1.1 HCV基因亚型：P1-P5与28份对照样品中有11份样品(P3和10份对照)HCV核酸检测为阴性,其余样品核酸检测为阳性,并获得了HCV基因亚型分析结果。P1和P2均为3b基因亚型,P4、P5分别为3a、6n基因亚型,据此可以排除P4、P5与P1之间存在传播关系的可能性。在18份核酸阳性样品中,8份(C7、C12、C14、C15、C16、C19、C20、C28)的基因亚型与P1相同。1.2 HCV准种群分布：在基因亚型为3b的10份样品中,9份(P1、P2、C7、 C12、C14、C15、C16、C19、C28) PCR扩增成功并进行Hiseq测序。Hiseq测序结果经初步处理后,9份样品分别得到了约百万条核酸序列,获得的有效序列数为249 753～1086 333条(平均869 608条)。剔除重复序列后,获得了3-172个(平均48个)独特准种群的序列。统计每份样品中各准种群序列出现的频率并由高到低依次排序,频数最大(最优势)的前2条序列的频数之和占该样品所有准种群总序列的比例都超过了38%,其中4份样品(C7、C15、C19、C28)超过了85%,有3份样品(C7、C19、C28)甚至超过了97%。1.3基因离散率：9份样品的样品内平均基因离散率为0.5%-13.2%,其中P1、C7、C16的均大于6%,样品内平均基因离散率的大小与HCV感染时间长短没有相关性。9份样品的样品间平均基因离散率为10.8%～25.0%,P1和P2间平均基因离散率为19.0%,与P1和其余7份样品间的基因离散率差异无统计学意义(P0.05)。1.4系统进化树分析：从HCV序列数据库下载25条HCV 3b亚型参考株序列,与9份样品的准种群序列一起进行系统进化树分析。结果显示,P2、C12、C14、C15、C16、C19、C28的准种群各自聚集为一簇；C7的部分准种群和P1聚集为一簇,其余准种群单独聚集为一簇。和P1聚集在一簇的那部分C7准种群和P1间的平均基因离散率为6.4%(0～13.3%),这与P1和其余7份样品间基因离散率的差异有统计学意义(P0.05)。系统进化分析结果提示P1和C7间可能存在直接或间接的HCV传播关系。鉴于HCV可能存在多重感染的特点,在HCV传播关系的调查中样品间基因离散率的最小值这一指标比样品间平均基因离散率更有价值。2.两个美沙酮门诊静脉注射吸毒HCV感染者间的传播关系研究2.1 HCV基因亚型：美沙酮门诊H和L共有13份样品HCV核酸检测为阴性,其余样品核酸检测为阳性,并获得了HCV基因亚型分析结果。美沙酮门诊H有2份样品(H8、H12) HCV核酸检测为阴性；在11份核酸阳性样品中,1份(H1 1)为3a/3b基因亚型；7份H1、H3、H4、H7、H9、H10、H13)为3b基因亚型,2份(H5、H6)为6a基因亚型,1份(H2)为6u基因亚型。美沙酮门诊L有11份样品(L3、L5、L6、L7、L11、L15、L17、L20、L25、L29、 L32) HCV核酸检测为阴性；在21份核酸阳性样品中,5份(L8、L18、L21、 L28、L31)为1a基因亚型；1份(L14)为3a/3b基因亚型；6份(L1、L10、L12、L13、L16、L24)为3b基因亚型；1份(L19)为6m/6n基因亚型；4份(L4、L22、L23、L30)为6n基因亚型；其余4份L9、L26、L27)分别为6a、1b、6u、3a基因亚型。1b基因亚型只有1份样品,可以排除该HCV感染者与其他感染者间存在传播关系的可能性。2.2 HCV准种群分布：对上述基因亚型分析成功且同一基因亚型不少于2份的所有样品(共31份)进行HVR1区PCR扩增,结果有27份样品扩增成功并进行Hiseq测序。Hiseq测序结果经初步处理后,27份样品分别获得的有效序列数为366980～2732511条(平均1432153条)。剔除重复序列后,分别获得2-207个(平均45个)独特准种群的序列。统计每份样品中各准种群序列出现的频率并由高到低依次排序,频数最大(最优势)的前2条序列占所有准种群总序列的比例均超过了16%,其中12份样品(H1、H3、H4、H6、H9、H11、H13、 L1、L8、L16、L18、L31)超过了82%,甚至有8份样品(H3、H4、H6、H9, L1、L16、L18、L31)超过了96%。2.3基因离散率：27份样品的样品内平均基因离散率为0.4%～26.0%,其中H2、H6、H9、L14、L19、L23、L28、L30的均大于5%。大部分样品之间的最小基因离散率均大于5%,部分样品之间的基因离散率最小值为0,样品H6和H9之间的基因离散率最小值为0.4%,H11和L23、L30之间的基因离散率最小值均为0.4%,L8和L21之间的样品基因离散率最小值为1.9%,L21和L28之间的基因离散率最小值为4.8%。2.4系统进化分析：样品L28、L31的准种群序列各自单独聚集为一簇,样品L8、L18、L21的所有准种群序列和L23、L30的部分准种群序列聚集为一簇；L8和L21之间的基因离散率最小值为1.9%,样品L8和L23、L18和L23、L18和L30、L21和L23、L21和L30之间的平均基因离散率最小值均为0。样品H6的部分准种群序列和H9的准种群序列聚集在一起,H6和H9之间的基因离散率最小值为0.4%。样品H3、L10、L12、L14的准种群序列各自聚集为一簇,样品H1、H4、H9、H10、H11、H13、L1分别和L23、L30的部分准种群序列聚集在一起,L24和L23的部分准种群序列聚在一起,H11和L23、L30之间的平均基因离散率最小值均为0.4%,L24和L23之间的平均基因离散率最小值为0,其余样品和L23、L30之间的平均基因离散率最小值均为0,系统进化树与基因离散率的结果共同提示同一门诊内部分感染者之间以及2个门诊部分感染者之间均可能存在直接或间接的HCV传播关系。结论1.本研究建立了基于HCV准种分析的Hiseq测序技术。2.静脉注射吸毒人群中HCV感染者体内HCV准种呈多样性分布的特点。3.通过对1例新近HCV感染者的溯源调查,排除了其共用针具的3个HCV感染者与他之间的潜在传播关系,并找到了新的传播线索。4.通过对2个美沙酮门诊的HCV感染者进行溯源分析,结果提示同一门诊内部分感染者之间、以及2个门诊部分感染者之间存在直接或间接的传播关系。5.鉴于HCV可能存在多重感染的特点,在HCV传播关系的调查中样品间基因离散率的最小值这一指标比样品间平均基因离散率更有价值。6.Hiseq测序具有高通量、操作较简便、成本相对低的特点,在HCV感染溯源调查中具有较高的实用价值。
【关键词】：丙型肝炎病毒 分子流行病学 高通量测序 准种
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.63
【目录】：

• 摘要6-11
• ABSTRACT11-18
• 前言18-21
• 1 研究对象21-27
• 2 主要仪器设备、试剂及耗材27-28
• 3 实验方法28-46
• 4 结果46-60
• 5 讨论60-63
• 6 结论63-64
• 参考文献64-69
• 附录1 已发表论文69-74
• 附录2 综述74-83
• 参考文献79-83
• 致谢83-84
• 个人简介84-85

【参考文献】

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本文编号：592522