胸腺B细胞在Treg发育中的作用研究及NK细胞在原发性胆汁性肝硬化致病机制中的研究

发布时间：2017-07-31 23:27

  本文关键词：胸腺B细胞在Treg发育中的作用研究及NK细胞在原发性胆汁性肝硬化致病机制中的研究

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【摘要】：第一部分胸腺B细胞在Treg发育中的作用及机制研究 调节性T细胞(Treg)是一群对于维持机体免疫耐受和免疫稳态至关重要的CD4+T细胞,特异性表达转录因子FoxP3。 Treg参与多种疾病的发病,并在其中发挥重要作用,如自身免疫性疾病、感染、过敏和肿瘤等。因为Treg细胞在免疫调节中扮演了重要角色,将Treg细胞作为疾病治疗的靶点极具临床应用前景,而探究Treg细胞的发育机制无疑为Treg细胞用于临床疾病治疗提供重要的基础理论参考。 外周免疫系统中的FoxP3+Treg细胞根据其来源的不同可以分为外周诱导产生的Treg细胞(p-Treg)和胸腺来源的Treg田胞(t-Treg), p-Treg细胞是在外周由经典的非Treg的CD4+T细胞在特定免疫微环境中诱导产生,而t-Treg细胞是在胸腺中由CD4单阳性胸腺细胞发育而来,t-Treg是构成外周FoxP3+Treg细胞的主要成分。 t-Treg在胸腺中的发育主要分为两个阶段：第一个阶段是从CD4单阳性T细胞在经过TCRβ-MHC II和CD28-CD80/86选择和刺激后生成CD25+FoxP3-Treg前体细胞；第二个阶段是从Treg前体细胞向成熟Foxp3+Treg细胞的转化,这个过程是细胞因子IL-2所依赖的。在t-Treg的发育过程中,多种抗原递呈细胞,如：树突状细胞,胸腺髓质区上皮细胞促进了t-Treg的发育和分化。胸腺B细胞也是正常存在于胸腺组织的一种抗原递呈细胞,但其在胸腺发育中的作用,特别是在t-Treg发育中的作用仍然不清楚,因此,我们将探究胸腺B细胞在t-Treg发育过程中所行使的功能,从而深刻认识Treg细胞的发育机理。我们已取得的实验结果如下： 1.胸腺B细胞参与胸腺Treg的发育 通过免疫组化染色我们发现,胸腺B细胞和胸腺Treg细胞均定位于胸腺的髓质区；流式分析B细胞敲除的FoxP3-GFP小鼠胸腺细胞时,发现胸腺中B细胞的缺失不影响CD4单阳性和CD8单阳性胸腺细胞,但胸腺Treg细胞的比例和数目均显著的下降；同时,我们利用体外胸腺B细胞和胸腺CD4单阳性细胞共培养的实验直接证实了胸腺B细胞能够诱导Treg细胞的产生。 2.胸腺B细胞通过细胞-细胞间的接触的方式促进胸腺Treg细胞发育 通过体外培养实验,我们发现胸腺B细胞促进胸腺Treg细胞的发育是细胞-细胞间的接触所依赖的,而与胸腺B细胞所分泌的细胞因子无关；进一步的实验分析,我们发现胸腺B细胞促进胸腺Treg细胞发育所依赖的细胞-细胞间接触是由胸腺B细胞表面的MHCⅡ分子和CD40,CD80和CD86这些共刺激分子所介导的。 3.胸腺B细胞促进CD4单阳性胸腺细胞生成Treg前体细胞 在体外胸腺B细胞和胸腺Treg前体细胞共培养的实验中,我们发现胸腺B细胞不具备诱导胸腺Treg前体细胞向成熟Foxp3+Treg细胞转化的能力；相反,在胸腺B细胞和胸腺CD4单阳性细胞共培养的实验中,我们发现胸腺B细胞显著的促进了胸腺CD4单阳性细胞生成Treg前体细胞。 4.胸腺B细胞的参与促进胸腺Treg细胞增殖 在分析B细胞敲除的FoxP3-GFP小鼠胸腺中Treg细胞时,我们发现胸腺B细胞的缺失导致了处在增殖状态的胸腺Treg细胞比例显著下降；另外在胸腺Treg细胞体外增殖的培养实验中,我们发现胸腺B细胞的加入能够显著的促进胸腺Treg细胞的增殖。 5.胸腺B细胞表面的MHC Ⅱ分子和CD40/CD80/86分子在促进胸腺Treg细胞增殖中扮演不同的角色 在胸腺B细胞和胸腺Treg细胞共培养的实验中加入表面分子的特异性阻断抗体,阻断由这些分子所介导的信号传递,我们发现胸腺B细胞所提供的MHCⅡ分子参与到促进胸腺Treg细胞增殖中,但胸腺B细胞来源的CD40、CD80和CD86这些共刺激分子并不参与其中。 综上所述,我们发现胸腺B细胞在胸腺Treg细胞发育过程中的作用及其作用机制,阐明了胸腺B细胞主要是通过两种机制来维持胸腺Treg细胞的正常数目,第一个机制是促进胸腺Treg细胞的发育,第二个机制是促进成熟胸腺Treg细胞的增殖,这些发现加深了我们对t-Treg发育的认识。 第二部分NK细胞在原发性胆汁性肝硬化致病机制中作用及机制的研究 原发性胆汁性肝硬化(PBC)是由于自身免疫系统攻击肝内胆管上皮细胞而引起的慢性胆汁淤积性肝脏疾病,该自身免疫疾病的病理学特征为：肝内中小胆管的破坏,汇管区炎症细胞的浸润。PBC病人肝脏汇管区浸润的淋巴细胞有B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞和巨噬细胞,同时还包含有NK细胞。至今我们都在密切关注适应性免疫细胞在PBC疾病发生中的作用,并取得了多个研究成果,却鲜见针对天然免疫细胞,特别是NK细胞在该疾病发生中作用的研究。肝脏是一个天然免疫占优势的器官,NK细胞做为天然免疫细胞在肝脏中含量很高,人肝脏淋巴细胞中NK细胞约占25%-40%,在鼠中也有10%-20%的含量。 在我们以前的工作中发现PBC病人的外周血和肝脏中NK细胞的比例和数目均是显著的增加：并且相对于健康的对照组,来自于病人的NK细胞体外杀伤能力以及穿孔素的表达均显著性增强,但NK细胞分泌细胞因子的能力却显著下降。虽然以上这些结果显示了PBC病人中NK细胞的表型发生了显著性改变,但是NK细胞在该疾病发生中的作用以及NK细胞与其他效应细胞的作用仍然不清楚。在此研究中,我们以dnTGF-βRⅡ模型小鼠做为研究对象,来揭示NK细胞在PBC样疾病发生中的作用及其机制。已取得的结果如下： 1.在dnTGF-βRⅡ鼠中,肝脏NK细胞抑制自身免疫性胆管炎 对NK细胞和肝脏炎症的数据进行线性回归分析,我们发现在dnTGF-βRⅡ鼠中,肝脏NK细胞比例与肝脏中单个核细胞的数目呈负相关性；进一步我们发现在dnTGF-βRⅡ鼠中敲除NK细胞显著的加重了肝脏汇管区淋巴细胞的浸润和肝内胆管的破坏。 2.肝脏NK细胞通过抑制肝脏CD4+T细胞反应来抑制肝脏炎症 我们发现在dnTGF-βRⅡ鼠中敲除NK细胞显著的增加了肝脏CD4+T细胞的数目；进一步我们利用转输诱导胆管炎模型,将脾脏中的CD4+T细胞和CD8+T细胞共转输到Rag1-/-或者NK-/-Rag1-/-小鼠体内,发现NK-/-Rag-/-小鼠肝脏中显著增加的是CD4+T细胞,而不是CD8+T细胞。 3.肝脏DX5-NK细胞作为CD4+T细胞的负性调节因子 利用体外CD4+T细胞增殖抑制实验,我们确定肝脏DX5-NK细胞具有抑制CD4+T细胞增殖的能力,相反肝脏DX5+NK细胞具有促进CD4+T细胞增殖的潜能；同时,我们还发现肝脏DX5NK细胞的比例与肝脏单个核细胞数目和肝脏CD4+T细胞比例均呈显著的负相关性。 总之,我们揭示了肝脏NK细胞在dnTGF-βRⅡ模型小鼠肝脏炎症中的免疫负调功能,这种负调功能是通过抑制肝脏CD4+T细胞来实现的；进一步我们阐明了两种不同肝脏NK细胞亚群在PBC样疾病发生中的不同功能。这些发现加深了我们对PBC发病机制的认识。
【关键词】：胸腺B细胞 胸腺Treg细胞 发育 共刺激分子 抗原递呈分子 细胞-细胞间接触 原发性胆汁性肝硬化 dnTGF-βR Ⅱ小鼠 NK细胞 CD4~+T细胞 DX5~-NK细胞 负调功能
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.22
【目录】：

• 摘要5-9
• ABSTRACT9-14
• 符号说明14-16
• 图序16-18
• 目录18-22
• 第一部分 胸腺B细胞在Treg发育过程中的作用及机制研究22-76
• 第一章 Treg细胞胸腺发育和分化研究进展绪论22-42
• 1.1 前言22-23
• 1.2 调节性T细胞的概述23-29
• 1.2.1 调节性T细胞的概况23-24
• 1.2.2 调节性T细胞的发育和分化24-27
• 1.2.3 调节性T细胞的功能27-29
• 1.3 抗原递呈细胞在胸腺来源的调节性T细胞发育过程中作用的研究29-33
• 1.3.1 髓质区上皮细胞在胸腺来源的调节性T细胞发育过程中作用及其机制29-31
• 1.3.2 树突状细胞在调节性T细胞的发育过程中的作用及其机制31-33
• 1.4 胸腺B细胞的概述33-40
• 1.4.1 胸腺B细胞的特性33-36
• 1.4.2 胸腺B细胞的发育和分化36-38
• 1.4.3 胸腺B细胞的功能38-40
• 1.5 特色及创新之处40-42
• 第二章 实验材料及方法42-60
• 2.1 实验材料42-46
• 2.1.1 小鼠信息42
• 2.1.2 实验试剂42-46
• 2.2 主要实验仪器46-47
• 2.3 实验方法47-60
• 2.3.1 病理制片47-49
• 2.3.2 免疫组化染色49-50
• 2.3.3 免疫荧光染色50-51
• 2.3.4 小鼠胸腺/脾脏单个核细胞分离51-52
• 2.3.5 流式检测细胞表面及胞内分子52
• 2.3.6 BrdU细胞掺入实验52-53
• 2.3.7 细胞分选53-55
• 2.3.8 细胞培养实验55-58
• 2.3.9 统计学分析方法58-60
• 第三章 实验结果60-76
• 3.1 引言60-61
• 3.2 胸腺B细胞和胸腺Treg细胞在胸腺中共定位61-62
• 3.3 胸腺B细胞处在高度活化的状态62
• 3.4 胸腺B细胞高表达趋化因子受体CCR662-63
• 3.5 胸腺B细胞的增殖能力增强63-64
• 3.6 胸腺B细胞缺失后胸腺Treg的比例和数目下降64-65
• 3.7 胸腺B细胞能够促进胸腺CD4单阳性细胞生成Treg细胞65-66
• 3.8 胸腺B细胞具有与胸腺DC细胞相同的促进Treg产生的能力66-67
• 3.9 胸腺B细胞促进胸腺Treg细胞产生不依赖于分泌的细胞因子67-68
• 3.10 胸腺B细胞促进胸腺Treg细胞产生依赖于MHC Ⅱ分子以及共刺激分子CD40/CD80/CD86所介导的细胞与细胞间接触68-69
• 3.11 胸腺B细胞能够促进胸腺pre-Treg细胞生成,但不能促进pre-Treg细胞向成熟Foxp3~+Treg细胞转化69-70
• 3.12 胸腺B细胞能够促进胸腺Treg细胞的增殖70-71
• 3.13 胸腺B细胞促进胸腺Treg细胞增殖依赖于MHC Ⅱ分子所介导的接触而不依赖CD40/CD80/CD86所介导的共刺激71-72
• 3.14 小结与讨论72-76
• 第二部分 NK在PBC模型鼠疾病发生中的作用及机制研究76-102
• 第四章 NK在PBC模型鼠疾病发生中的作用及机制76-102
• 4.1 实验材料76-78
• 4.1.1 小鼠信息76
• 4.1.2 实验试剂76-78
• 4.2 实验方法78-85
• 4.2.1 病理制片及H&E染色78-80
• 4.2.2 小鼠肝脏及脾脏单个核细胞分离80
• 4.2.3 流式检测细胞表面分子及细胞因子分泌能力80-81
• 4.2.4 肝脏组织蛋白提取,BCA定量81
• 4.2.5 CBA检测81-82
• 4.2.6 细胞分选82-83
• 4.2.7 体外NK细胞的抑制实验83-84
• 4.2.8 ELISA(AMA浓度的检测)84
• 4.2.9 统计学分析方法84-85
• 4.3 实验结果85-102
• 4.3.1 引言85-86
• 4.3.2 dnTGF-β RⅡ模型小鼠中肝脏炎症的严重程度与NK细胞的数目呈负相关86-87
• 4.3.3 NK细胞缺失后,dnTGF-βRⅡ模型小鼠自身免疫性胆管炎加重87-88
• 4.3.4 NK细胞缺失的dnTGF-βRⅡ模型小鼠血清AMAs的浓度升高88-89
• 4.3.5 NK细胞缺失后,dnTGF-βRⅡ模型小鼠体内炎性细胞因子的浓度增加89-90
• 4.3.6 NK细胞缺失后,dnTGF-βRⅡ模型小鼠中CD4~+T细胞反应增强90-92
• 4.3.7 在转输诱导胆管炎模型中NK细胞能够抑制肝脏炎症92-93
• 4.3.8 在转输诱导胆管炎模型中NK细胞表现出具有抑制CD4~+T细胞反应的功能93
• 4.3.9 在体外dnTGF-β RⅡ模型小鼠中肝脏NK细胞能够促进CD4~+T细胞的增殖93-95
• 4.3.10 dnTGF-βRⅡ模型小鼠中DX5~+和DX5~-两个肝脏NK细胞亚群的表型差异95
• 4.3.11 dnTGF-βRⅡ模型小鼠中肝脏DX5~-NK细胞抑制CD4~+T细胞的增殖95-97
• 4.3.12 结果与讨论97-102
• 参考文献102-114
• 致谢114-116
• 在读期间发表的学术论文与其他研究成果116-118
• 附录118-122

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 SHI YaoYao;ZHU MingZhao;;Medullary thymic epithelial cells,the indispensable player in central tolerance[J];Science China(Life Sciences);2013年05期

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本文编号：601609