华支睾吸虫溶血磷脂酶与肝纤维化发生发展的相关机制研究

发布时间：2017-08-01 05:02

  本文关键词：华支睾吸虫溶血磷脂酶与肝纤维化发生发展的相关机制研究

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【摘要】：研究背景与目标肝纤维化是机体应对慢性肝细胞损伤发起的过度修复反应,需要肝星状细胞(HSCs)、炎症细胞和免疫细胞的参与。作为引起全球发病率和死亡率的一个主要原因,目前临床上尚无特异性抗纤维化治疗的药物。华支睾吸虫病是一种由华支睾吸虫感染引起的食源性寄生虫病,流行于东亚以及东南亚地区,也是我国流行广泛、影响人们生活质量的食源性寄生虫病之一。华支睾吸虫成虫寄生在宿主的肝内胆管,长时间的寄生造成宿主肝脏的慢性损伤,引起一系列的肝胆管疾病。在这一系列的肝胆管疾病中,华支睾吸虫感染引起的肝纤维化,我们对于其发生机制所知甚少。溶血磷脂酶(Lyso PLA)作为磷脂酶家族的成员之一,存在于多种哺乳动物的组织和细胞、寄生虫以及细菌中。溶血磷脂酶除了发挥水解溶血磷脂的生理功能外,在寄生虫和真菌致病过程中也发挥着重要作用。在华支睾吸虫中,我们克隆表达出了溶血磷脂酶,发现其不但发挥催化磷脂的酶活性,而且能活化人肝星状细胞系LX-2细胞。提示我们华支睾吸虫溶血磷脂酶(Cs Lyso PLA)与华支睾吸虫感染所致的肝纤维化过程可能存在着联系。因此本研究主要对华支睾吸虫溶血磷脂酶在肝纤维化发生发展过程中的作用及机制进行初步探讨,为华支睾吸虫病的防治提供新的理论依据。研究方法1.Cs Lyso PLA免疫血清的制备用重组的Cs Lyso PLA与弗氏完全佐剂(初次免疫)或弗氏不完全佐剂(加强免疫)等体积混合,经腹部皮下多点注射免疫SD大鼠、经背部皮下多点注射免疫新西兰兔,每隔两周加强免疫一次,共两次,每次免疫之前和末次免疫两周后大鼠尾静脉取血和兔耳缘静脉取血,分离血清。2.Cs Lyso PLA在华支睾吸虫囊蚴感染BALB/c小鼠肝脏和血清中的表达囊蚴经灌胃感染BALB/c小鼠0、7、30、60、90、135和180天,分别取其肝脏和血液。将肝脏进行包埋、切片,对肝组织切片进行Cs Lyso PLA免疫组织化学染色;将血液离心取血清,ELISA检测Cs Lyso PLA含量。3.Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠,每周两次,共18周。肝脏进行包埋、切片或液氮速冻;血液离心取血清。4.Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠肝组织炎症浸润和纤维化情况对Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠肝组织切片分别进行HE和Masson染色,光学显微镜下观察炎症浸润和纤维化情况。5.Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的检测将Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠的血清,按照血清ALT和AST检测试剂盒的说明进行检测。6.Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠肝组织α-SMA、Collagen-I的检测提取Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠液氮速冻肝组织的总蛋白,Western bloting检测α-SMA、Collagen-I的表达;并对肝组织切片进行α-SMA免疫荧光染色,荧光显微镜下观察,α-SMA染成红色。7.华支睾吸虫囊蚴感染和Cs Lyso PLA尾静脉注射的BALB/c小鼠IL-25的表达按照IL-25的ELISA检测试剂盒说明检测华支睾吸虫囊蚴感染和Cs Lyso PLA尾静脉注射的BALB/c小鼠血清IL-25含量;对两组小鼠肝组织切片进行IL-25的免疫组织化学染色,光学显微镜下观察;提取Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠液氮速冻的肝组织的总蛋白,Western bloting检测IL-25的表达。8.Cs Lyso PLA尾静脉注射的BALB/c小鼠肝组织IL-25和CD68免疫荧光双染对Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠肝组织切片进行IL-25和CD68免疫荧光双染色,荧光显微镜下观察,IL-25阳性细胞呈绿色,CD68阳性细胞呈红色。9.Cs Lyso PLA刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌IL-25的检测将Cs Lyso PLA与小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞孵育,提取总RNA和总蛋白,Q-PCR检测IL-25的m RNA的表达;Western bloting和细胞免疫荧光染色检测IL-25的蛋白表达。10.RAW264.7细胞分泌IL-25信号通路的检测24孔板中Cs Lyso PLA(10μg/ml)过滤除菌后加或不加H-89(20μM)或SC79(4μg/ml)刺激RAW264.7 24h;12孔板中,H-89(20μM)提前60min加入刺激细胞,再加入Cs Lyso PLA(10μg/ml)刺激15、30、60和90min;或SC79(4μg/ml)提前30min加入刺激细胞,再加入Cs Lyso PLA(10μg/ml)刺激15min、30min;PBS为阴性对照。11.IL-25对人肝星状细胞系LX-2细胞的作用IL-25在体外与LX-2细胞孵育,提取总RNA,Q-PCR检测α-SMA的m RNA水平;提取总蛋白,Western bloting检测α-SMA的蛋白水平;LX-2细胞爬片免疫荧光染色检测Collagen-I的表达;Transwell小室法观察IL-25对LX-2细胞迁移能力的影响。12.Cs Lyso PLA对TGF-β1诱导的LX-2细胞活化的作用将Cs Lyso PLA先于LX-2细胞孵育,再加TGF-β1刺激,提取LX-2细胞总的RNA,Q-PCR检测α-SMA、MMP2、Collagen-I的m RNA水平;提取总蛋白,Western bloting检测α-SMA的蛋白水平以及信号通路分子Smad3、JNK2、ERK1/2的活化水平;LX-2细胞爬片免疫荧光染色检测α-SMA的表达;CCK-8法检测LX-2细胞增殖能力的影响;Transwell小室法观察对LX-2细胞迁移能力的影响。研究结果1.华支睾吸虫感染BALB/c小鼠的肝组织免疫组织化学染色显示Cs Lyso PLA在感染30d时检测到表达,在60d和90d表达量最大,随着感染时间的延长表达量减少。ELISA检测血清中Cs Lyso PLA的表达,发现感染30d成虫分泌开始增加,90d分泌量达到最高,随着成虫在体内存活时间的延长其分泌逐渐减少。Cs Lyso PLA在肝组织和血清中表达的变化趋势与华支睾吸虫感染小鼠不同阶段肝脏胶原纤维的变化情况一致,提示Cs Lyso PLA与C.sinensis感染所致的肝纤维化存在着关联性。2.对Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠肝组织进行HE和Masson染色,结果显示肝组织有着明显的炎症细胞浸润和纤维胶原沉积,并且从静脉周围延伸至肝实质内。用赖氏法检测血清中肝细胞损伤指标ALT(丙氨酸氨基转移酶)和AST(天冬氨酸氨基转移酶)的活力,显示Cs Lyso PLA作用后的血清中ALT和AST活力水平显著的高于对照组,表明Cs Lyso PLA可引起肝脏的损伤。3.对Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠的肝组织进行HSCs活化标志α-SMA和Collagen-I的检测。Western bloting结果发现α-SMA和Collagen-I在Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠的肝组织中高表达;肝组织的α-SMA免疫荧光染色显示Cs Lyso PLA尾静脉注射组可见大量α-SMA染色阳性细胞,对照组未见,以上结果表明Cs Lyso PLA注射后可引起肝星状细胞的活化。4.为了研究IL-25是否与Cs Lyso PLA诱导的小鼠肝纤维化的形成有联系,对华支睾吸虫感染小鼠的血清进行检测,ELISA结果显示在感染7d时,血清中IL-25的含量显著高于对照组,60d时达到峰值,随着感染时间的延长IL-25含量减少,并且这种变化趋势与肝脏纤维化形成趋势一致。此外又对华支睾吸虫感染小鼠肝组织进行IL-25的免疫组织化学染色,结果发现对照组未见到IL-25阳性细胞,华支睾吸虫感染组散在分布着IL-25阳性细胞。在Cs Lyso PLA尾静脉注射组,血清中IL-25虽然与对照组相比IL-25含量无统计学上的差异,但是我们利用Western bloting检测到IL-25在Cs Lyso PLA尾静脉注射组肝组织中的表达,并且免疫组织化学染色检测结果显示Cs Lyso PLA尾静脉注射组肝组织中分布着IL-25阳性细胞,而对照组则未见到。提示IL-25与Cs Lyso PLA尾静脉注射小鼠肝纤维化的形成有关系。5.为了检测IL-25的分泌细胞,对Cs Lyso PLA尾静脉注射BALB/c小鼠肝组织进行IL-25与巨噬细胞表面标志分子CD68荧光双染,免疫荧光染色可见IL-25和CD68染色双阳性的细胞,说明IL-25与CD68分子共染在巨噬细胞上,提示Cs Lyso PLA尾静脉后可刺激肝脏的巨噬细胞分泌IL-25。6.为了进一步验证IL-25的分泌细胞,用Cs Lyso PLA刺激小鼠巨噬细胞系RAW264.7,分别利用Q-PCR、Western bloting和细胞免疫荧光技术在m RNA和蛋白水平检测IL-25的表达情况,发现Cs Lyso PLA能够刺激RAW264.7细胞分泌IL-25。随后又对分泌IL-25的相关信号通路进行检测发现了RAW264.7细胞分泌IL-25是由PKA依赖的Braf-ERK1/2信号通路介导的。7.HSCs的活化是肝纤维化发生的中心环节,为了研究IL-25与肝纤维化的关系,用IL-25刺激人肝星状细胞系LX-2细胞。在m RNA水平,与对照组相比,IL-25诱导LX-2细胞活化标志物α-SMA的表达增高;Western Bloting结果显示α-SMA的蛋白在IL-25和TGF-β1刺激下表达量均有显著性的增高。为了验证NF-κB对α-SMA表达的影响,加入NF-κB抑制剂-BAY11-7083,发现与IL-25单刺激组相比,α-SMA的蛋白表达量下降。说明IL-25可能是通过NF-κB相关的信号通路刺激LX-2细胞的活化。此外,在IL-25刺激LX-2细胞后,利用Western Bloting和细胞免疫荧光染色技术对Collagen-I进行检测,发现IL-25刺激后Collagen-I的表达显著高于对照组。此外我们又发现IL-25能够促进LX-2细胞迁移。8.TGF-β1是一种强有效的促肝纤维化的细胞因子,但是我们实验中发现Cs Lyso PLA能够减低TGF-β1活化LX-2细胞的α-SMA、MMP2、Collagen-I基因的m RNA水平;抑制TGF-β1活化LX-2细胞的α-SMA蛋白的表达;并且这种抑制是通过减弱TGF-β1相关的信号分子Smad3、JNK2、ERK1/2的磷酸化实现的;此外Cs Lyso PLA还抑制TGF-β1诱导的LX-2的增殖和迁移。研究结论Cs Lyso PLA一方面刺激宿主巨噬细胞分泌IL-25,IL-25通过激活HSCs发挥促纤维化的作用;另一方面通过抑制Smad3、JNK、ERK的磷酸化,从而抑制TGF-β1活化HSCs的功能。Cs Lyso PLA究竟是发挥促纤维化作用或抑制纤维化的作用,可能与华支睾吸虫感染的时段、感染度和反复感染状态以及宿主免疫功能等因素相关。
【关键词】：肝纤维化 华支睾吸虫溶血磷脂酶 肝星状细胞 巨噬细胞 IL-25
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2;R532.23
【目录】：

• 中文摘要3-9
• 英文摘要9-15
• 英文缩略词15-18
• 前言18-21
• 第一章 Cs Lyso PLA诱导IL-25 介导的肝纤维化形成21-66
• 第一节 Cs Lyso PLA在华支睾吸虫囊蚴感染BALB/c小鼠体内表达21-31
• 1 材料21-23
• 2 方法23-26
• 3 结果26-29
• 4 讨论29-30
• 5 小结30-31
• 第二节 Cs Lyso PLA诱导BALB/c小鼠肝纤维化的形成31-40
• 1 材料31-32
• 2 方法32-35
• 3 结果35-38
• 4 讨论38-39
• 5 小结39-40
• 第三节 Cs Lyso PLA诱导肝纤维化的形成与巨噬细胞分泌的IL-25 有关40-66
• 1 材料40-41
• 2 方法41-49
• 3 结果49-63
• 4 讨论63-65
• 5 小结65-66
• 第二章 Cs Lyso PLA抑制TGF-β1 诱导的LX-2 细胞的活化66-75
• 1 材料66-67
• 2 方法67-68
• 3 结果68-73
• 4 讨论73-74
• 5 小结74-75
• 全文总结75-76
• 参考文献76-84
• 附录84-85
• 致谢85

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本文编号：602592