α-亚麻酸和花生四烯酸对HepG2细胞CYP7A1表达的影响及Nrf2的调控

发布时间：2017-08-02 10:41

  本文关键词：α-亚麻酸和花生四烯酸对HepG2细胞CYP7A1表达的影响及Nrf2的调控

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【摘要】：非酒精性脂肪肝(Nonalcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是一种常见的肝脏慢性疾病,其特点是有少量或没有饮酒史个体的肝脏细胞中出现过量甘油三酯(TAG)集聚或脂肪变性。NAFLD在西方国家常发,与肥胖症,代谢综合征和2型糖尿病等紧密关联,并且成为肝衰竭的主要原因,通过研究发现,多数需要进行肝脏移植治疗的病例也都有NAFLD的参与。在NAFLD的疾病进程中,脂肪酸的代谢异常会触发机体的氧化应激和脂质过氧化反应,进而诱发抗氧化反应的中枢调节者Nrf2的表达量明显增多。核转录因子Nrf2可以调控细胞对抗外来异物和氧化应激引起的损伤,是调节机体内氧化还原平衡的关键核转录因子。Nrf2作为机体防御机制的关键中枢,可作为治疗多种肝脏疾病的药物作用靶点,如非酒精性脂肪肝炎、肝硬化、急性肝损伤以及肝癌等。同时,作为NAFLD的疾病特征,胆固醇堆积也能加重内质网应激和细胞凋亡,从而加重NAFLD程度。在肝脏中,胆固醇7α-羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)在将胆固醇转化为胆汁酸中主要作用的经典合成途径中,起到限速酶的作用,催化胆汁酸合成的第一步反应,从而能够将胆固醇转化成7α-羟化胆固醇。本实验室前期研究结果表明,高脂诱导的小鼠发生NAFLD时药物代谢酶CYP7A1 mRNA的表达量明显下降,而Nrf2表达量升高,且NAFLD模型小鼠肝脏伴随α-亚麻酸(ALA)和花生四烯酸(AA)的异常升高。为了研究NAFLD疾病进程中CYP7A1 mRNA表达量降低与脂肪酸代谢异常的关系,以及Nrf2是否调控CYP7A1的表达,进行了本课题的研究:首先构建Nrf2的特异性siRNA和过表达质粒,然后将Nrf2的特异性siRNA和过表达质粒通过脂质体介导的方法瞬时转染入HepG2细胞中,建立HepG2细胞Nrf2沉默和过表达模型。在分析ALA和AA两种脂肪酸诱导HepG2细胞对Nrf2和CYP7A1表达量影响的基础上,研究ALA和AA诱导对Nrf2沉默和过表达细胞CYP7A1的mRNA和蛋白质表达量的影响,探讨脂肪酸应激刺激诱导的CYP7A1的变化与Nrf2的相关性。采用MTT法确定本试验中ALA和AA的诱导浓度为0.25mmol/L、0.5mmol/L和1mmol/L。与空白对照组相比,脂肪酸作用诱导后,HepG2细胞Nrf2 mRNA和蛋白质的表达量增加,且成剂量依赖性;采用ALA诱导后,HepG2细胞CYP7A1mRNA和蛋白质的表达量成剂量依赖性升高,而采用AA诱导后,HepG2细胞CYP7A1mRNA和蛋白质的表达量则成剂量依赖性降低。当转染si-Nrf2使Nrf2沉默后,ALA和AA诱导CYP7A1 mRNA和蛋白质表达量的趋势与对照组相同,但每个浓度作用下与对照组相比都有所升高,当转染Nrf2过表达质粒使Nrf2过表达后,ALA和AA诱导CYP7A1 mRNA和蛋白质表达量的趋势与对照组相同,但每个浓度作用下与对照组相比却都有所降低。以上结果表明,ALA的诱导量与HepG2细胞CYP7A1的表达量呈正相关,而AA的诱导量与HepG2细胞CYP7A1表达量呈负相关,Nrf2是调控ALA和AA诱导CYP7A1表达的通路之一。
【关键词】：α-亚麻酸 亚油酸 Nrf2 CYP7A1 过表达 沉默
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.5
【目录】：

• 摘要8-9
• Abstract9-11
• 1 前言11-19
• 1.1 非酒精性脂肪肝病11-12
• 1.1.1 NAFLD的发病机制11-12
• 1.1.2 脂肪酸与NAFLD的关系12
• 1.2 脂肪酸12-14
• 1.2.1 脂肪酸的分类12-13
• 1.2.2 饱和脂肪酸13
• 1.2.3 不饱和脂肪酸13-14
• 1.2.4 NAFLD与脂肪酸14
• 1.3 核转录因子NF-E2相关因子14-16
• 1.3.1 Nrf2的结构和功能14-15
• 1.3.2 Nrf2与NAFLD15
• 1.3.3 Nrf2与CYP450酶15-16
• 1.4 CYP7A1研究进展16-17
• 1.4.1 CYP7A1概述16
• 1.4.2 胆固醇对CYP7A1的调节16-17
• 1.4.3 脂肪酸对CYP7A1的调节17
• 1.5 研究目的和意义17-19
• 2 材料和方法19-29
• 2.1 试验材料19-22
• 2.1.1 试验细胞19
• 2.1.2 主要仪器设备19
• 2.1.3 药品和试剂19-20
• 2.1.4 溶液配制20-22
• 2.2 试验方法22-29
• 2.2.1 HepG2细胞的培养22
• 2.2.2 ALA和AA对HepG2细胞诱导浓度的选择22-23
• 2.2.3 瞬时过表达Nrf2细胞模型的建立23-24
• 2.2.4 瞬时沉默Nrf2细胞模型的建立24-25
• 2.2.5 ALA和AA对HepG2细胞Nrf2和CYP7A1蛋白质表达量的影响25-26
• 2.2.6 ALA和AA对HepG2细胞Nrf2和CYP7A1 mRNA表达量的影响26-27
• 2.2.7 ALA和AA对Nrf2基因沉默HepG2细胞CYP7A1表达的影响27-28
• 2.2.8 ALA和AA对Nrf2基因过表达HepG2细胞CYP7A1表达的影响28
• 2.2.9 统计学分析28-29
• 3 结果29-44
• 3.1 不同浓度的ALA和AA对HepG2细胞活性的影响29
• 3.2 ALA和AA对HepG2细胞Nrf2和CYP7A1表达的影响29-33
• 3.2.1 ALA和AA对HepG2细胞Nrf2 mRNA表达量的影响29-30
• 3.2.2 ALA和AA对HepG2细胞Nrf2蛋白质表达量的影响30-31
• 3.2.3 ALA和AA对HepG2细胞CYP7A1 mRNA表达量的影响31-32
• 3.2.4 ALA和AA对HepG2细胞CYP7A1蛋白质表达量的影响32-33
• 3.3 质粒转染条件的优化33-35
• 3.3.1 荧光显微镜检测HepG2细胞质粒转染效率33
• 3.3.2 质粒转染时间对HepG2细胞Nrf2蛋白质表达量的影响33-34
• 3.3.3 质粒转染时间对HepG2细胞Nrf2 mRNA表达量的影响34-35
• 3.4 siRNA转染条件的优化35-38
• 3.4.1 荧光显微镜检测siRNA转染效率35
• 3.4.2 不同siRNA序列对HepG2细胞Nrf2沉默效率的影响35-36
• 3.4.3 siRNA转染时间对HepG2细胞Nrf2蛋白质表达量的影响36-37
• 3.4.4 siRNA转染时间对Nrf2 mRNA表达量的影响37-38
• 3.5 沉默或过表达Nrf2对HepG2细胞CYP7A1表达的影响38-40
• 3.6 ALA和AA诱导对Nrf2沉默或过表达HepG2细胞CYP7A1蛋白质表达的影响40-42
• 3.6.1 ALA对Nrf2沉默或过表达HepG2细胞CYP7A1蛋白质表达量的影响40-41
• 3.6.2 AA对沉默或过表达Nrf2的HepG2细胞CYP7A1蛋白质表达量的影响41-42
• 3.7 ALA和AA对沉默或过表达Nrf2 HepG2细胞的CYP7A1 mRNA表达量的影响42-44
• 3.7.1 ALA对沉默或过表达Nrf2的CYP7A1 mRNA表达量的影响42-43
• 3.7.2 AA对沉默和过表达Nrf2的HepG2细胞CYP7A1 mRNA表达量的影响43-44
• 4 讨论44-48
• 4.1 细胞系和脂肪酸种类的选择44
• 4.2 不同浓度脂肪酸对细胞活性的影响44-45
• 4.3 ALA和AA对Nrf2表达的影响45
• 4.4 ALA和AA对CYP7A1表达的影响45-46
• 4.5 Nrf2基因沉默和过表达模型的建立46-47
• 4.6 Nrf2沉默和过表达后ALA和AA对CYP7A1表达的影响47-48
• 5 结论48-49
• 致谢49-50
• 参考文献50-59
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文59

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