αSNAP调控重症急性胰腺炎大鼠肠道紧密连接损伤的机制研究

发布时间：2017-08-08 04:12

  本文关键词：αSNAP调控重症急性胰腺炎大鼠肠道紧密连接损伤的机制研究

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【摘要】：研究背景与目的:重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是临床上常见的危急重症,起病急、进展快、病死率高。在其发病早期,可出现MODS(multiple organ dysfunction syndrome)和 SIRS(systemic inflammatory response syndrome)等严重并发症。研究表明,SAP早期除了胰腺局部损伤外,同时伴随大量细胞因子产生、激活和释放,造成肠道紧密连接相关蛋白occludin等表达下降,促使肠道通透性增加,肠源性感染加重,诱发和加重全身并发症。研究证实可溶性NSF附着蛋白α(α-SNAP)可调节包括Occludin、Claudin蛋白在内的肠道紧密连接蛋白的表达,从而影响肠道通透性。已证实αSNAP对AMPK有负性调节作用。本研究拟通过构建重症急性胰腺炎模型,检测重症急性胰腺炎时,AMPK对肠道紧密连接蛋白的调节关系,进而影响肠道通透性的变化,为重症急性胰腺炎肠道屏障的保护提供理论依据。方法:1.动物实验SD大鼠共30只,随机分为5组,每组6只。分别给予腹腔注射20%浓度的L-精氨酸溶液2.0g/kg来诱导重症急性胰腺炎(SAP组),共3组,轻症急性胰腺炎(MAP组)1组,给予注射1.0g/kg诱导,对照组给予腹腔注射等量生理盐水。诱导成功后,将3个SAP组随机分为重症Compound C组(Com组)、重症Glucosamine组(Gln组)和重症对照组(SAP组)。Com组给予Compound C溶液2 ml灌胃,浓度为10 nm/L,每隔8h一次。Gln组给予谷氨酰胺溶液2ml灌胃,浓度为1g/kg体重·天,每隔8h一次。在最后一次注射后的24h和48h分别处死各组大鼠的一半,对大鼠胰腺和小肠上皮做HE染色,观察其病理变化,并进行病理评分。通过检测肠道漏出的FITC-dextran的量,间接反映肠道通透性的变化。用免疫组化和western blot检测AMPK、αSNAP和occludin表达水平的变化。2.细胞实验小肠上皮细胞HIEC转染αSNAP shRNA慢病毒;通过Western blot检测细胞AMPK、αSNAP和occludin蛋白的表达水平。结果:1.动物实验1)胰腺组织病理:胰腺的HE染色中,对照组无明显变化;MAP组大鼠胰腺组织仅见轻微充血,少量炎细胞浸润;SAP组胰腺大片状坏死、炎性细胞浸润明显;重症Com组和重症Gln组胰腺病理改变明显轻于SAP组。在24h和48h时胰腺组织病理评分分别为:对照组(0.17±0.26,0.33±0.41);MAP 组(7.00±0.63;6.92±0.81);SAP组(14.08±0.86;14.67±0.68);Com组(12.00±0.71;12.50±0.78);Gln 组(12.67±0.88;12.17±0.82)。各组间比较p0.05。2)空肠上皮组织病理:光镜下观察,对照组肠黏膜未见明显损伤,绒毛形态完整;MAP组肠绒毛稍有缩短;SAP组肠绒毛炎症细胞浸润,绒毛形态不规则,破坏明显,黏膜坏死脱落;重症Com组与重症Gln组肠黏膜相对较完整,少量坏死和肠绒毛缩短。在24h和48h小肠上皮组织病理评分分别为:对照组(1;1);MAP组(1.83±0.75;2.00±0.63);SAP 组(3.50±0.55;4.33±0.52);Com 组(3.00±0.63;3.33±0.52);Gln组(3.00±0.63;3.50±0.55)。各组间比较p0.05。3)肠道通透性检测:SAP组大鼠的肠道通透性升高明显,重症Com组与重症Gln组的肠道通透性相对SAP组有所回复。24h和48h渗透出的FITC-dextran荧光值:对照组(0.22±0.14;0.51±0.61);MAP 组(99.59±5.34;102.42±5.26);SAP 组(394.17±19.93;410.25±7.80);Com 组(363.00±18.45;372.95±9.33);Gln 组(351.08±17.69;367.93±18.90)。各组间比较p0.05。4)免疫组化法(IHC)检测肠上皮细胞蛋白表达:SAP组大鼠相对于对照组和MAP组,肠上皮细胞AMPK蛋白表达升高,occludin和αSNAP蛋白表达降低;Com组和Gln组相对SAP组,肠上皮细胞中AMPK表达降低,occludin和αSNAP表达增高。5)免疫印迹(Western blot)检测肠上皮紧密连接蛋白表达:检测造模后48h处死大鼠的肠上皮细胞,结果与免疫组化结果基本一致,SAP组大鼠肠上皮细胞AMPK表达升高,occludin和αSNAP表达降低;Com组和Gln组相对SAP组,AMPK表达降低,occludin和αSNAP表达增高。2.细胞实验转染αSNAP shRNA慢病毒后,HIEC细胞的αSNAP表达下调,AMPK表达上调,同时occludin表达也下调;再向细胞培养基中加入Compound C抑制AMPK的表达,occludin的表达水平上调。结论:1.SAP大鼠的肠道上皮细胞中AMPK表达水平增高,导致occludin蛋白表达降低,损伤肠道中的紧密连接,增加肠屏障通透性。2.αSNAP可能通过负性调节AMPK调控occludin蛋白表达。3.Compound C以及谷氨酰胺对肠屏障有保护作用。
【关键词】：急性胰腺炎 腺苷酸活化蛋白激酶 Compound C 肠道通透性 αSNAP 紧密连接 occludin
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R576
【目录】：

• 缩略语表5-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 腺苷酸活化蛋白激酶在大鼠重症急性胰腺炎肠道紧密连接损伤中的作用12-27
• 1.1 前言12-13
• 1.2 实验动物分组13
• 1.3 主要试剂与仪器13-15
• 1.4 试剂配制15-16
• 1.5 各组实验动物模型的制作方法16
• 1.6 各指标检测及方法16-20
• 1.7 统计分析20
• 1.8 实验结果20-25
• 1.9 讨论25-26
• 1.10 小结26-27
• 第二章 AMPK在αSNAP调节肠上皮细胞occludin蛋白表达中的作用27-37
• 2.1 前言27-28
• 2.2 实验材料28-29
• 2.3 试剂配制29-30
• 2.4 细胞培养30-31
• 2.5 实验指标及检测31-34
• 2.6 统计分析34
• 2.7 实验结果34-35
• 2.8 讨论35-36
• 2.9 小结36-37
• 全文总结37-38
• 参考文献38-41
• 文献综述 肠黏膜屏障损伤与黏膜屏障保护41-52
• 参考文献47-52
• 攻读硕士学位期间发表的论文52-53
• 致谢53

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本文编号：638159