ERK-MLCK通路介导褪黑素对食管上皮紧密连接作用的机制研究

发布时间：2017-08-09 20:21

  本文关键词：ERK-MLCK通路介导褪黑素对食管上皮紧密连接作用的机制研究

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【摘要】：胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)是指胃内容物反流入食管,引起不适症状和(或)并发症的一种疾病。胃酸被认为是GERD的重要致病因子。食管粘膜防御功能下降对于GERD的发生具有重要意义。食管粘膜防御屏障:由上皮屏障完成,包括上皮细胞膜和细胞间紧密连接(tight junction,TJ)。研究发现,GERD患者食管上皮存在细胞间隙增宽(dilated intercellular spaces,DIS),这是食管上皮连接屏障受损的标志。跨膜蛋白occludin、claudin通过支架蛋白ZO-1固定于细胞骨架、使相邻细胞间形成“拉链”式连接、共同构成TJ的结构基础,维持上皮连接屏障的完整性。大量实验室及临床研究提示,TJ蛋白表达或分布异常,可作为GERD食管上皮连接屏障受损的客观指标。然而,目前其分子机制尚不清楚。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号通路是真核细胞中介导细胞反应的重要信号系统。MAPK信号系统包括细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK。不同组织及细胞研究发现,ERK、JNK和p38 MAPK均可参与细胞连接屏障的调节过程;其中,关于ERK调节细胞连接屏障的报道最多。在未受刺激的细胞中,MAPK信号分子主要分布于细胞质中;在适宜刺激下,多个MAPK家族成员被激活,迅速且显著的移入细胞核中、活化转录因子、调节参与细胞反应的基因的转录表达。MAPK信号通路通过影响肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)的表达及活性,实现对细胞连接屏障的调节。MLCK是一种钙调蛋白(calmodulin,Ca M)依赖性激酶,广泛存在于上皮细胞中。MLCK通过磷酸化肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC),使三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)依赖的肌动球蛋白收缩,由此引起的细胞骨架收缩、胞膜回缩、DIS形成、TJ蛋白ZO-1、occludin和claudin-1分布变化,这是细胞连接屏障损伤的经典机制。MLCK还可改变胞内Ca2+浓度、调节TJ蛋白的表达、影响细胞连接屏障。研究发现,在肠上皮细胞中,ERK活化促使下游转录因子Elk-1活化并入核,触发MLCK基因活化、m RNA转录、蛋白合成、上皮连接屏障开放、粘膜通透性增加。但迄今为止,尚未见食管上皮连接屏障调控机制的相关研究报道。当前,质子泵抑制剂(proton pump inhibitors,PPIs)因其强大的抑制胃酸作用,被作为GERD的一线治疗药物。由于GERD慢性过程、易复发的特点,患者需要长期使用PPI,且久用PPI有许多副作用。2006年一项研究显示,口服褪黑素(melatonin,MLT)可以显著缓解GERD患者的症状而未见副作用;大量实验证实,MLT对GERD/RE食管粘膜具有保护作用。MLT是一种吲哚胺神经激素,具有复杂的生物学效应,包括调节睡眠周期、昼夜节律、生殖节律、血压波动,调节免疫功能,清除氧自由基,抑制肿瘤生长等等;给予外源性MLT,通过多种途径可以保护消化道粘膜。在视网膜屏障、肾小管上皮细胞、肠上皮细胞、人脐静脉内皮细胞等多项研究中发现:(1)MLT通过调节细胞骨架来影响TJ,发挥对细胞连接屏障的保护作用。(2)MLT还通过抑制MAPK信号途径、调控MLCK表达以及活性,保护人脐静脉内皮细胞连接屏障。(3)MLT可特异性的与钙调蛋白(calmodulin,Ca M)及PKC相互作用,抑制MLCK活性。文献报道关注了MLT在抗炎、抗氧化机制上、对GERD的治疗作用。本研究以食管上皮连接屏障(即TJ屏障)为靶点,探讨MLT对TJ的保护作用(及其机制),为GERD治疗提供了新的思路。第一部分胃食管反流病食管上皮细胞间隙及紧密连接蛋白变化目的:探讨胃食管反流病(GERD)患者食管上皮细胞间隙增宽(DIS)及紧密连接(TJ)蛋白变化的可能机制。方法:根据“纳排标准”将胃镜检查的患者分为对照组、NERD组和RE组。用一次性活检钳夹取食管下段(齿状线上3-5CM)光滑无破损的粘膜组织分别保存于液氮、4%多聚甲醛、3%戊二醛备用。用透射电镜观察患者食管上皮细胞间隙,免疫组化检测TJ蛋白的分布、real-time PCR检测TJ基因m RNA表达,western blot检测TJ蛋白、MAPK和MLCK的表达。结果:(1)NERD和RE患者的食管上皮细胞间隙均较对照组显著增宽,且主要见于棘细胞层。(2)与对照组相比,NERD和RE患者TJ m RNA和蛋白表达均显著降低;免疫组化显示,NERD和RE患者的TJ蛋白在胞膜附近的连续性被破坏,部分食管上皮细胞中TJ蛋白出现了表达缺失。(3)NERD和RE患者的食管上皮细胞MLCK表达水平和活性均显著上调;MAPK信号分子中,ERK1/2磷酸化水平显著上调,JNK和p38MAPK无明显变化。(4)对DIS和TJ蛋白、MLCK表达/活性进行相关性分析,结果显示:DIS与TJ蛋白水平呈负相关,与MLCK表达/活性呈正相关。结论:GERD患者食管上皮出现明显DIS;食管上皮TJ蛋白表达减少、且表达的连续性破坏;MLCK和ERK1/2可能参与以上病变过程。第二部分ERK-MLCK通路介导酸损伤食管上皮紧密连接目的:探讨酸对食管上皮细胞紧密连接的作用及机制。方法:培养正常人食管上皮细胞(Het-1A)。(1)用台盼蓝细胞计数法检测不同酸性条件下、不同培养时间,Het-1A细胞的活力,用上皮电阻仪和荧光分光光度计分别检测Het-1A细胞单层的跨上皮电阻(TER)和FITC-dextran通透性。(2)用western blot、real-time PCR和激光共聚焦免疫荧光方法,分别检测酸(p H4.0)作用1h、6h后,TJ蛋白表达及分布变化。(3)分别用特异性ERK抑制剂(PD98059)和MLCK抑制剂(ML-7)预处理Het-1A细胞,再给予酸(p H4.0)作用1h,western blot检测ERK1/2磷酸化以及western blot、real-time PCR检测MLCK表达/活性。(4)用si ERK1/2使ERK1/2基因表达沉默,通过western blot、real-time PCR检测ERK1/2表达沉默对MLCK的影响;用si MLCK使MLCK基因表达沉默,通过western blot、real-time PCR、激光共聚焦免疫荧光、跨上皮电阻(TER)和FITC-dextran通透性实验,分别检测MLCK表达沉默对TJ表达/分布以及Het-1A细胞单层连接屏障的影响。(5)提取细胞核蛋白,通过western blot检测酸对相关转录因子活化的情况。(6)用小干扰RNA沉默被酸活化的转录因子基因,检测转录因子沉默对MLCK表达的影响。(7)用ERK抑制剂(PD98059)预处理Het-1A细胞,再给予酸(p H4.0),检测酸对转录因子的活化是否受到抑制。结果:(1)酸(p H4.0)作用1h时,Het-1A细胞单层的TER显著降低、FITC-dextran通透性显著增高。(2)酸显著下调TJ蛋白表达水平、改变其分布,使TJ蛋白从致密、均匀、连续的胞膜表达变成了以胞浆表达为主伴随少量、不连续的胞膜表达。(3)PD98059能够显著抑制酸对ERK1/2的激活作用;ML-7显著抑制由酸上调的MLCK活性,但不影响MLCK表达;PD98059既可以抑制酸上调的MLCK表达,又可以抑制酸上调的MLCK活性。(4)ERK1/2表达沉默可以明显抑制酸对MLCK表达的上调作用;MLCK表达沉默可以改善由酸破坏的Het-1A连接完整性、通透性增高,以及TJ蛋白表达和分布变化。(5)酸可以活化Het-1A细胞中的转录因子Elk-1与NF-κB。(6)Elk-1表达沉默可以显著抑制由酸上调的MLCK表达,NF-κB表达沉默则未见明显影响。(7)ERK活性受到抑制后,由酸激活的Elk-1的磷酸化水平也随之下调。结论:(1)酸通过下调TJ蛋白ZO-1、occludin和claudin-1表达水平、改变TJ蛋白分布,从而损伤食管上皮细胞连接屏障。(2)ERK1/2-Elk-1-MLCK信号途径介导了酸对食管上皮细胞TJ蛋白的调节,这可能是酸损伤食管上皮细胞连接屏障的机制。第三部分褪黑素通过ERK-MLCK通路保护食管上皮紧密连接目的:探讨褪黑素(MLT)对酸作用下食管上皮细胞紧密连接的作用及机制。方法:(1)用不同浓度(0.1μM、1μM、10μM和20μM)和不同时间(2h、4h、6h、8h、12h)的MLT预处理Het-1A细胞、再给予酸作用,检测Het-1A细胞单层的TER和FITC-dextran通透性。(2)将Het-1A细胞分成4组:对照组、MLT组、酸处理组、MLT+酸处理组。分别用real-time PCR和western blot方法检测ZO-1、occludin和claudin-1的m RNA和蛋白表达水平,激光共聚焦免疫荧光检测其表达和分布情况。(3)将Het-1A细胞分为5组:对照组、酸处理组、PD+酸处理组、MLT+酸处理组、MLT+PD+酸处理组。分别检测ERK1/2磷酸化水平、MLCK表达水平和活性,以及转录因子Elk-1表达情况。结果:(1)MLT可以改善酸导致的Het-1A细胞单层TER降低、FITC-dextran通透性增高。(2)MLT显著改善由酸导致的ZO-1、occludin和claudin-1的m RNA和蛋白表达下调、分布改变。(3)PD+酸处理组、MLT+酸处理组和MLT+PD+酸处理组中,酸导致的ERK1/2磷酸化、MLCK表达和活性上调均被明显抑制,酸对转录因子Elk-1的活化也显著受抑;三组之间无显著差异。结论:MLT通过ERK1/2-Elk-1-MLCK信号转导途径调节TJ蛋白ZO-1、occludin和claudin-1表达及分布,从而改善了酸对食管上皮细胞连接屏障的破坏作用。
【关键词】：胃食管反流病 DIS 紧密连接 MLCK ERK1/2 酸 食管上皮连接屏障 紧密连接 ERK1/2 MLCK 转录因子 褪黑素 酸 食管上皮 紧密连接 ERK1/2 MLCK Elk-1
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R571
【目录】：

• 中文摘要5-10
• Abstract10-17
• 第一部分 胃食管反流病食管上皮细胞间隙及紧密连接蛋白变化17-46
• 1. 前言17-19
• 2. 材料和方法19-29
• 3. 结果29-37
• 4. 讨论37-40
• 5. 结论40-41
• 6. 参考文献41-46
• 第二部分 ERK-MLCK通路介导酸损伤食管上皮紧密连接46-81
• 1. 前言46-48
• 2. 材料和方法48-55
• 3. 结果55-71
• 4. 讨论71-74
• 5. 结论74-75
• 6. 参考文献75-81
• 第三部分 ERK-MLCK通路介导褪黑素保护食管上皮紧密连接81-102
• 1. 前言81-83
• 2. 材料和方法83-85
• 3. 结果85-91
• 4. 讨论91-94
• 5. 结论94-95
• 6. 参考文献95-102
• 全文小结102-105
• 综述105-123
• 参考文献112-123
• 附录一 中英文对照及缩略表123-125
• 附录二 攻读学位期间科研工作小结125-128
• 致谢128

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本文编号：647136