缺血再灌注条件下IEC来源的BMP4和IL-7相互作用调节IEL凋亡研究

发布时间：2017-08-11 01:16

  本文关键词：缺血再灌注条件下IEC来源的BMP4和IL-7相互作用调节IEL凋亡研究

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【摘要】：研究背景:肠缺血再灌注损伤(ischemic/reperfusion,I/R)是在严重感染、创伤、心肺功能不全、器官移植等的过程中常见组织器官损伤之一。肠粘膜屏障是一个复杂的屏障结构,主要由机械屏障、免疫屏障、生物屏障、化学屏障等不同组分组成。其中由肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IEC)和肠上皮间淋巴细胞(intestianl intr aepithelial lymphocytes,IEL)为主组成的机械屏障和免疫屏障是决定肠屏障功能的核心因素。IEL作为一群主要由T淋巴细胞组成的特殊细胞群构建的肠免疫屏障,IEC与IEL相互紧密,IEC可通过分泌的蛋白因子直接接触作用于IELs,调控IEL的增殖、分化、凋亡等。因此深入研究探讨IEC对IEL的调控机制,将有助于阐明应激条件下肠粘膜屏障功能障碍的发病机制。在肠道遭受到I/R损伤后,肠粘膜屏障在维持肠道内环境稳定、阻碍内毒素转移等功能受到限制,其中最主要的原因是肠上皮细胞和肠上皮间淋巴细胞组成的机械屏障、免疫屏障受到极大破坏。前期研究发现小肠在胃肠外营养、缺氧、缺血再灌注刺激下肠黏膜上皮细胞内BMP4蛋白分泌表达增加,BMP4通过传导下游信号可促进促炎因子的释放,进一步加重肠黏膜屏障功能损伤。已有研究发现胸腺上皮细胞来源的BMP4可通过Smad信号影响前体细胞CD34+的成熟,进而抑制胸腺内T淋巴细胞的分化,使机体的免疫功能下降,而IL-7可以抵消BMP4对CD34+的影响。IELs作为肠道特殊免疫淋巴细胞,在维持肠黏膜免疫屏障功能稳定起重要作用。在TPN和I/R刺激下,IEL的功能降低、数量减少、凋亡增加使肠黏膜屏障功能障碍加重。为了进一步研究在缺血再灌注下肠上皮细胞对肠上皮间淋巴细胞的调控机制。因此,本文拟通过体外实验检测在缺血再灌注刺激下肠上皮细胞来源的BMP4和IL-7相互作用调节肠上皮间淋巴细胞凋亡的研究而展开的,为在缺血再灌注下IEC-IEL的对话机制研究提供一定的实验基础。方法:1.制作小鼠肠I/R损伤模型,6小时后颈椎脱臼处死小鼠,取出小肠上段空肠组织制作石蜡切片和冰冻切片,HE染色观察肠黏膜绒毛形态学变化,免疫荧光技术检测肠上皮细胞内BMP4、IL-7蛋白表达变化。2.将小鼠颈椎脱臼处死,取全程小肠,提取小鼠肠IEL细胞,采用RT-PCR、流式细胞术验证IEL中存在BMP信号通路蛋白表达。3.将小鼠缺血再灌注处理6小时后,提取肠上皮间淋巴细胞,用Sham作为对照组,用流式细胞术检测在IEL中BMP和IL-7信号通路蛋白表达变化。4.将提取的IEL单独培养,加入外源性BMP4、IL-7蛋白,采用流式细胞术检测IEL的凋亡率表达变化。5.给予外源性IL-7蛋白刺激IEC-6、IEL后,Western-blot、流式技术检测胞内BMP4、p-NF-k B蛋白表达变化。6.在IEC-6、IEL中给予外源性BMP4蛋白刺激后,Western-blot、流式技术检测胞内IL-7、IL-7R/CD127蛋白表达变化。结果:1.肠缺血再灌注处理6小时后,光镜下发现肠黏膜部分绒毛断裂、细胞脱落、部分结构消失。同时,免疫荧光技术观察到肠IEC内BMP4蛋白表达明显增强,绒毛内的IL-7蛋白表达明显减少。2.在IEL中通过RT-PCR琼脂糖凝胶电泳发现存在BMP经典信号通路关键分子BMPRIA、BMPRIB、Smad1、Smad5、Smad8、p-NF-k B的表达,同时用流式技术验证IEL中存在BMPRIA、BMPRIB、p-NF-k B的表达。3.小鼠小肠在缺血再灌注条件下,IEL中BMPRIA、BMPRIB、P-Smad1/5、p-NF-k B表达量较Sham组明显增高,同时IL-7R/CD127、P-STAT5表达明显减少。4.给予外源性BMP4刺激后,可诱导IEL的凋亡率增加。给予NOGGIN、PDTC、IL-7联合刺激后,IEL中的IEL凋亡率与Control组无明显差异。5.在IL-7刺激下,IEC中BMP4表达下调,IEL中BMP信号下调。6.给予外源性BMP4刺激下,IEC-6中IL-7蛋白表达下调,在IEL中的IL-7R/CD127及P-STAT5蛋白表达减少.结论:1.在I/R损伤刺激下,肠黏膜部分绒毛断裂、细胞脱落、结构消失,肠屏障功能遭到极大破坏;肠黏膜上皮细胞内BMP4蛋白表达增加、IL-7表达减弱。2.IEL中存在BMP信号通路表达,且在肠I/R损伤刺激下IEL内BMP信号通路的激活。3.BMP4通过与IEL内BMP受体结合,激活Smad、NF-k B信号通路,进一步诱导IEL的凋亡率增加。4.在外源性IL-7刺激下,BMP信号通路在肠IEC与IEL中传递受到抑制,阻碍BMP4对IEL的凋亡促进作用。5.在I/R下,肠黏膜细胞中IL-7/CD127信号通路蛋白表达减少,给予外源性BMP4刺激后,IL-7/CD127信号通路传递抑制,进一步加重肠粘膜屏障功能受损。
【关键词】：缺血再灌注损伤 肠黏膜上皮间淋巴细胞 肠黏膜上皮细胞 BMP4 IL-7
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R574
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 在缺血再灌注条件下BMP信号在肠上皮细胞和肠上皮间淋巴细胞中表达变化的研究13-34
• 2.1 材料与方法13-24
• 2.2 实验结果24-31
• 2.3 讨论31-34
• 第三章 在缺血再灌注下IL-7 与BMP4相互作用调控肠上皮间淋巴细胞凋亡的研究34-48
• 3.1 材料和方法34-40
• 3.2 实验结果40-45
• 3.3 讨论45-48
• 全文总结48-49
• 参考文献49-51
• 文献综述 BMP信号通路在肠道缺血再灌注损伤中的作用51-59
• 参考文献55-59
• 学位期间发表的论文59-60
• 致谢60

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本文编号：653563