HNF4α抑制非酒精性脂肪性肝炎进展的机制研究

发布时间：2017-08-12 02:09

  本文关键词：HNF4α抑制非酒精性脂肪性肝炎进展的机制研究

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【摘要】：[研究背景及目的]非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)目前已成为全世界范围内慢性肝病最主要的原因。其发病机制与肥胖和胰岛素抵抗相关,疾病谱包括单纯性非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、NASH相关的肝纤维化和肝癌。大量研究证实,NASH是NAFLD患者发展为肝硬化和肝癌的必经阶段,且NASH与患者死亡率显著相关。迄今为止,NASH的发病机制尚未完全清晰,也无公认有效的针对性药物治疗方案。因此研究NASH发生发展过程及其机制并找到有效的防治方案具有重要意义。肝细胞核因子 4α(hepatocyte nuclear factor,HNF4α)属于孤核受体(orphan nuclear receptor,NR),是在肝脏中强势表达的转录因子,对胆汁酸、脂质、葡萄糖和药物代谢的诸多基因具有关键调控作用,在肝细胞分化及维持肝、肠及胰岛β细胞的稳态中占有重要地位,是肝细胞重要的标志物。其在肝脏中的靶基因参与葡萄糖[PEPCK基因(PCK1)、L-丙酮酸激酶(L-PK,PKLR)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase,G6PC)]和外源性药物的代谢(CYP7A1,CYP3A4、CYP2D6等),调控脂质转运,特别是调控编码载脂蛋白(APO,APOA2,APOA4、APOB、APOC2,APOC3,和APOC4)相关基因,与胆固醇和甘油三脂代谢密切相关。基于HNF4α在糖脂代谢调控中的关键作用,我们认为HNF4α可能用于NASH的治疗,成为其新的防治靶点。[实验方法]一、小鼠NASH进程与HNF4α表达的关系采用蛋氨酸—胆碱缺乏性饮食(MCD)喂养小鼠建立NASH模型,Real-time RT-PCR及Western印迹法检测喂养不同时间段小鼠肝脏HNF4α表达水平,HE染色、油红O染色及天狼星红染色观察小鼠肝脏病理变化,同时检测脂代谢相关基因表达及炎症通路激活情况。二、特异性下调肝脏内HNF4α表达对小鼠NASH进程的影响采用LoxP-Cre系统特异性敲除成年小鼠肝脏内HNF4α,并构建MCD饮食致NASH小鼠模型,研究HNF4α表达下调对小鼠肝脏病理、肝内HNF4α、脂代谢相关基因表达、炎症通路激活情况、肝脏及血清内甘油三酯(TG)的水平的影响。三、上调肝脏内HNF4α表达水平对小鼠NASH的治疗性实验利用C57BL/6小鼠构建MCD饮食致NASH模型,并以MCS对照饮食小鼠为正常对照,MCD小鼠分别按照2×109efu尾静脉注射AdHNF4α或AdGFP腺病毒,3w后处死小鼠,Real-time RT-PCR及Western印迹法检测肝脏HNF4α及脂代谢相关基因表达、炎症通路激活情况;试剂盒检测肝脏及血清内甘油三酯(TG)的水平;HE染色、油红O染色及天狼星红染色观察小鼠肝脏病理变化。四、统计分析数据运用SPSS 13软件进行统计分析,多组间采用One-Way ANOVA分析,配对资料采用配对t检验,方差非齐性则采用非参数检验,P0.05为具有显著性差异。[实验结果]一、小鼠NASH进程中HNF4α表达逐渐下降1.MCD饲料喂养小鼠2w、4w、6w、8w后,发现随着喂养时间增加,MCD组小鼠一般情况明显变差,体型瘦小,精神状况差,到8w后出现眼周脱毛现象。Real-time RT-PCR、Western印迹法及病理染色发现随着MCD饲料喂养时间增加,HNF4α表达量逐渐降低,肝脏脂质沉积逐渐加重,6周后出现轻微纤维化,8w时HNF4α可下降约80%。2.MCD喂养小鼠后可使小鼠脂肪合成指标如乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl CoA carboxylase,ACC)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、硬脂酞辅酶A去饱和酶(stearoyl-coenzyme A desaturase,SCD-1)、固醇调节元件结合蛋白-1(sterol regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate response element binding protein,ChREBP)、氧化物酶体增殖剂激活受体 γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma，，PPARγ)表达下降,此为 MCD饲料特殊性。小鼠肝脏内脂肪分解指标表达明显下降,肝脏转运脂肪能力下降,Toll 样受体(Toll-like receptor 2,TLR2)、TLR4/NF-κB、IL-6/JAK2/STAT3 及TGFβ1/Smad3等炎症通路被激活。二、特异性下调肝脏内HNF4α表达加快小鼠NASH的发展1.利用Loxp-Cre系统特异性敲除肝脏内HNF4α使其表达下降后,获得肝特异性 HNF4α 敲除 HNF4αH-KO 小鼠。MCD 饮食 4w 后,Real-time RT-PCR 及 Western 印迹法检测发现HNF4α表达明显下降,且HNF4αH-KO小鼠较对照组体型瘦小,精神状况差,肝脏油腻发黄,边缘钝。2.病理改变:与对照组比较,HNF4αH-kO小鼠肝脏肝小叶结构破坏,并见大量脂肪空滴及炎症细胞浸润,细胞出现气球样变;油红O染色见较多红色脂滴,肝脏脂质含量明显增多,提示HNF4α表达下降后小鼠肝脏脂肪变性加重;天狼星红染色两组均未见明显纤维沉积。3.Real-time RT-PCR及Western印迹法检测发现HNF4αH-KO小鼠较对照组脂肪合成指标(ACC、FAS、PPARγ等)明显增多,肝脏分解脂肪能力下降,且肝脏内TG 含量明显增多。TLR2、TLR4/NF-κB、IL-6/JAK2/STAT3 及 TGFβ1/Smad3 等炎症相关基因及通路活性增加。三、上调肝脏内HNF4α表达可减轻小鼠实验性NASH1.MCD小鼠精神状态差,体型瘦弱,眼周毛发及胡须脱落,肝脏发黄油腻;经尾静脉注射AdHNF4α腺病毒后,与AdGFP组相比,精神状态较好,毛发及胡须无明显脱落,肝脏色泽形态较正常。2.HE染色、油红O染色及天狼星红染色显示AdGFP组小鼠肝脏脂肪变性及炎细胞浸润严重,胶原沉积增多;AdHNF4α治疗后小鼠脂肪变性及炎细胞浸润现象明显改善,肝脏内脂质含量明显下降,未观察到明显胶原沉积。3.Real-time RT-PCR及Western印迹法检测脂代谢和炎症通路相关指标,发现AdHNF4α治疗组HNF4α表达明显较AdGFP组增多,肝脏分解脂肪能力改善、炎症相关信号通路基因表达下降。[结论]一、NASH小鼠肝脏内HNF4α表达较正常小鼠明显下降。二、下调HNF4α表达可加重小鼠NASH进程。三、上调HNF4α表达可减轻小鼠NASH发展,其机制与改善脂代谢、抑制肝脏炎症反应有关,HNF4α可能成为NASH治疗新靶点。
【关键词】：肝细胞核因子4α(HNF4α) 非酒精性脂肪性肝炎(NASH) 蛋氨酸—胆碱缺乏 性(MCD)饮食
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.1
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-13
• 中英文缩略词对照表13-15
• 前言15-17
• 第一部分 小鼠NASH进程与HNF4α表达的关系17-37
• 一、材料19-21
• 二、方法21-28
• 三、结果28-35
• 四、讨论35-37
• 第二部分 特异性下调肝脏内HNF4α表达对小鼠NASH的影响37-51
• 一、材料38
• 二、方法38-43
• 三、结果43-49
• 四、讨论49-51
• 第三部分 上调肝脏内HNF4α表达对小鼠NASH的治疗作用51-62
• 一、材料52
• 二、方法52-55
• 三、结果55-61
• 四、讨论61-62
• 全文结论62-63
• 参考文献63-67
• 综述67-75
• References72-75
• 在读期间发表论文和参与科研75-76
• 致谢76-77

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本文编号：659258