重组人肝活素（HPS）的抗肝损伤活性研究

发布时间：2017-08-16 19:22

  本文关键词：重组人肝活素（HPS）的抗肝损伤活性研究

  更多相关文章： 急性肝衰竭 肝损伤 肝活素 标志物

【摘要】：肝脏是人体内重要的功能器官,具有代谢、解毒、免疫、凝血等多种作用;但肝脏易受多种因素刺激,轻则导致肝功能紊乱,重则引起急性肝衰竭,甚至死亡。肝病在我国一直是一个严重的公共卫生问题,病毒、药物等导致的严重肝损伤(肝衰竭)都具有起病急、预后差、病死率高的特点,目前临床上尚缺乏有效的治疗手段,研究并找到不仅可以阻止肝细胞坏死、而且能促进肝再生的药物一直是临床上面临的重大课题。Hepassocin(HPS)是一种具有肝脏组织特异性的促有丝分裂因子,通过自分泌循环的方式调节正常肝细胞的增殖,对CCl_4、D-氨基半乳糖(D-galN)诱导的肝损伤具有较好的降酶保肝作用。本课题依据HPS的生物学特性,对HPS开展临床前抗肝损伤活性研究,包括动物模型评价和体外评价两部分:在动物模型评价方面,首先利用CCl_4诱导的肝损伤模型确定HPS的给药方案即造模前12h,造模后24h、48h、72h给药,建立给药谱,在此基础上研究HPS对此模型小鼠的保护作用,我们发现HPS能提高肝损伤小鼠的存活率,降低ALT、AST水平,HE染色结果表明HPS能降低肝组织坏死程度,酶联免疫吸附(TUNEL)结果显示HPS能减少肝细胞凋亡,增殖细胞核抗原(PCNA)结果表明HPS能促进肝细胞的增殖。通过D-galN/LPS诱导的肝损伤模型进一步评价HPS的活性,发现HPS同样可以降低小鼠的死亡率、转氨酶水平、肝组织坏死程度,Real-time PCR法检测凋亡及炎症因子的m RNA水平,CBA法检测血清中炎症因子的表达,证明HPS可降低相关凋亡及炎症因子的表达。此外,本研究还评价了HPS对CCl_4、D-galN诱导大鼠肝损伤、刀豆蛋白A(Con A)诱导小鼠肝损伤的保护作用。体外评价结果显示,HPS能促进小鼠原代肝细胞的增殖、降低CCl_4处理对L02细胞的损伤。本研究检测了不同剂量CCl_4诱导小鼠急性肝损伤及肝切除模型HPS在小鼠血清中的表达变化,并比较了HPS的表达与肝损伤程度的相关性,发现随着CCl_4剂量的增加,小鼠死亡率显著升高,肝损伤程度增加,HPS在小鼠血清及肝组织中的表达水平也显著上调并与肝损伤程度密切相关;肝切除模型中HPS的血清表达上调。综上所述,HPS具有较好的抗肝损伤活性,其在血清中的水平与肝损伤程度密切相关,因此,HPS可能会成为特异性治疗ALF的有效药物以及判断肝损伤程度的血清标志物。
【关键词】：急性肝衰竭 肝损伤 肝活素 标志物
【学位授予单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-10
• 第一章 文献综述10-25
• 1.1 急性肝衰竭10-16
• 1.2 HPS结构特点及生物学功能16-18
• 1.2.1 HPS的结构特点16-17
• 1.2.2 HPS的生物学特性及功能17-18
• 1.3 肝损伤模型的损伤机制及应用18-23
• 1.3.1 化学性肝损伤模型18-20
• 1.3.2 药物性肝损伤模型20-22
• 1.3.3 免疫性肝损伤模型22
• 1.3.4 肝切除模型22
• 1.3.5 酒精性肝损伤模型22-23
• 1.3.6 其他因素诱导的肝损伤模型23
• 1.4 临床上检测肝功能的指标23-24
• 1.5 本课题研究的意义24-25
• 第二章 材料与方法25-36
• 2.1 主要仪器设备25
• 2.2 实验材料25-28
• 2.2.1 主要试剂25-26
• 2.2.2 细胞株26
• 2.2.3 实验动物26
• 2.2.4 常用溶液配制26-28
• 2.3 实验方法28-36
• 2.3.1 常用细胞培养条件28
• 2.3.2 实验动物肝损伤模型28-30
• 2.3.3 肝损伤模型动物存活率观察30
• 2.3.4 血清ALT、AST水平检测30-31
• 2.3.5 HE染色及组织学观察31
• 2.3.6 TUNEL检测细胞凋亡31-32
• 2.3.7 PCNA抗体免疫组化检测肝细胞的再生能力32
• 2.3.8 组织RNA的提取与反转录32
• 2.3.9 Real-time PCR32
• 2.3.10 Caspase 3 活性检测32-33
• 2.3.11 CBA法检测细胞因子33
• 2.3.12 酶联免疫吸附法 (ELISA)检测HPS在血清中的表达33
• 2.3.13 组织蛋白的提取与定量33-34
• 2.3.14 细胞总蛋白的提取34
• 2.3.15 小鼠原代肝实质细胞的分离34
• 2.3.16 MTS法检测细胞增殖34
• 2.3.17 乳酸脱氢酶（LDH）的检测34-35
• 2.3.18 统计学分析35-36
• 第三章 结果与讨论36-74
• 3.1 HPS的体内抗肝损伤活性研究36-61
• 3.1.1 HPS减轻CCl_4诱导的小鼠急性肝损伤36-48
• 3.1.2 HPS减轻CCl_4诱导的大鼠急性肝损伤48-50
• 3.1.3 HPS减轻D-gal N/LPS诱导的小鼠肝损伤50-57
• 3.1.4 HPS减轻D-gal N诱导的大鼠肝损伤57-59
• 3.1.5 HPS降低Con A诱导的免疫性肝损伤小鼠转氨酶水平59-60
• 3.1.6 小结60-61
• 3.2 HPS的体外活性研究61-67
• 3.2.1 HPS促进小鼠原代肝细胞增殖61-62
• 3.2.2 HPS减轻CCl_4诱导的肝细胞损伤62-65
• 3.2.3 HPS促进Hep G2及小鼠原代肝细胞MAPK/ERK信号通路活化65-66
• 3.2.4 小结66-67
• 3.3 HPS是一种新的小鼠急性肝损伤标志物67-74
• 3.3.1 肝切除模型中HPS的表达变化67-68
• 3.3.2 不同剂量CCl_4处理对小鼠生存状态的影响68-69
• 3.3.3 不同剂量CCl_4处理对小鼠肝功能的影响69-70
• 3.3.4 不同剂量CCl_4处理对小鼠肝脏组织结构的影响70-71
• 3.3.5 不同剂量CCl_4处理对小鼠HPS表达水平的影响71-72
• 3.3.6 小结72-74
• 第四章 结论与展望74-75
• 4.1 结论74
• 4.2 展望74-75
• 参考文献75-85
• 发表论文和参加科研情况说明85-86
• 附录86-89
• 致谢89-90

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本文编号：685077