清脂护肝方及Src抑制剂PP2在非酒精性脂肪性肝病中的作用机制探讨

发布时间：2017-08-31 17:40

  本文关键词：清脂护肝方及Src抑制剂PP2在非酒精性脂肪性肝病中的作用机制探讨

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【摘要】：背景：非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种以无过量饮酒史和其他明确肝损害因素引起的肝实质细胞的脂肪变性、坏死以及炎性细胞的浸润和脂肪积贮等为特征的临床病理综合症。非酒精性脂肪肝炎(Non-alcohlic Steatohepatitis, NASH)是指肝细胞脂肪变性、小叶和/或汇管区炎症,有时伴有肝纤维化和Mallory小体形成的一种病理状态,在NAFLD中占30%-50%,这是造成非酒精性脂肪性肝硬化、肝癌等并发症的重要环节,阻断这一环节就能够改变NAFLD的预后,因此探讨清脂护肝方及Src抑制剂PP2在NASH中的作用及其机制可为临床治疗NAFLD提供一定的理论依据。目的：通过观察清脂护肝方及Src抑制剂PP2对NASH大鼠肝功能、血脂、炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α)以及NASH大鼠肝组织和kupffer细胞中Src家族相关激酶(Hck、 Lyn、Fgr)和Src抑制的蛋白激酶C底物(Src-suppressed C kinase substrate, SSeCKS)表达的影响,探讨清脂护肝方及Src抑制剂PP2在NASH中的作用及其机制。方法：人体水平研究：选取2012-2014年南通市第三人民医院病理科经诊断为NAFLD的肝组织蜡块12例,以及正常肝组织10例,用免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)方法检测Src家族相关激酶(Hck、Lyn、Fgr)和SSeCKS分子的表达水平。细胞实验：qRT-PCR:培养生长状态良好的kupffer细胞,采用Trizol一步法提取RNA并反转录成cDNA,用q RT-PCR方法检测Src家族相关激酶(Hc、Lyn、Fgr)和SSeCKS分子mRNA的表达情况；培养生长状态良好的kupffer细胞,用60%浓度CCL4损伤液刺激4h[2]后用20%清脂护肝方药物血清(前期实验研究表明：清脂护肝方药物血清添加量为20%时,增值实验数据最高,效果最好)及Src抑制剂PP2(浓度为5、10、20、40ug/ml)继续培养48h后提取RNA,并反转录成cDN A,采用q RT-PCR方法检测药物干预前后Src家族相关激酶(Hck、 Lyn、Fgr)和SSeCKS分子mRNA的表达情况；免疫细胞化学(Immunocytochemistry, ICC):对生长状态良好的kupffer细胞,用60%浓度CCL4损伤液刺激4h后分别用20%清脂护肝方药物血清继续培养48h和Src抑制剂PP2刺激30min,用ICC的方法检测Src家族相关激酶(Hck、Lyn、Fgr)和SSeCKS分子的表达水平；蛋白质免疫印迹法(Western Blot):收集生长状态良好的kupffer细胞,提取蛋白,采用Western Blot的方法检测Src家族相关激酶(Hck、Lyn、Fgr)和 SSeCKS分子 mRNA的表达情况。动物实验：选用2月龄雄性SD大鼠喂养高脂饲料制备成NASH模型,将造模成功的大鼠再随机分为模型组、PP2组、低剂量清脂护肝方组、中剂量清脂护肝方组和高剂量清脂护肝方组,模型组予0.9%NaCl溶液灌胃；清脂护肝方组分别以2.43g/kg/d,12.15g/kg/d,24.3g/kg/d灌胃6周；PP2组于造模后第1天至第5天腹腔注射10mmol/LSrc抑制剂PP2 0.1ml,对照组注射等体积生理盐水。观察记录大鼠的行为表现及体质量变化。实验结束后,处死实验大鼠,采用OLYMPUS全自动生化分析仪及配套试剂检测肝功能及血脂；并对肝组织病理切片采用苏木精-伊红染色观察大鼠脂肪变性及炎症程度；IHC法检测NASH大鼠肝组织中Src家族相关激酶(Hck、Lyn、Fgr)和SSeCKS分子的表达水平；ELISA法检测血清中NASH炎症因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的表达情况。结果：人体水平研究：IHC结果表明：Hck、Lyn在人体正常肝组织中低表达,炎症组织中表达增高,二者比较有统计学意义(P0.05)；而在正常肝组织或肝脏炎症组织中Fgr、SSeCKS均未见明显表达。细胞实验：q RT-PCR:Hck、Lyn mRNA 在 Kuffer细胞中的表达丰度满足敲减实验要求,SSeCKS mRNA 在 Kuffer细胞中表达丰度较低,不满足敲减实验要求,而Fgr mRNA 在 Kuffer细胞中没有表达；用60%CCL4损伤液刺激后Hck、Lyn mRNA表达明显升高(P0.05), SSeCKS mRNA表达减少,但无统计学意义(P0.05)；用清脂护肝方药物血清及Src抑制剂PP2干预后：Hck、Lyn mRNA表达降低,且呈剂量依赖性；SSeCKS mRNA表达稍有升高,而Fgr mRNA未见表达。ICC:Hck 在 kupffer细胞中有表达,呈棕黄色颗粒,并与炎症程度呈正相关,药物血清及Src抑制剂PP2培养后表达减少,棕黄色颗粒明显变钱、变少,呈散在分布；而Lyn、Fgr和SSeCKS在kupffer细胞中无明显表达；Western Blot:Hck、Lyn、SSeCKS在鼠kupffer细胞中均有表达,尤以Hck、SSeCKS表达明显,而Fgr在鼠kupffer细胞中未见明显表达。动物实验：IHC结果表明：Lyn、Hck在正常肝脏组织kupffer细胞低表达,炎症刺激时高表达,且与炎症反应呈极高正相关；SSeCKS则在正常肝脏组织kupffer细胞低表达,炎症刺激时表达减少,与炎症反应程度呈负相关；Fgr在正常肝脏组织kupffer细胞极低表达,炎症刺激后几乎不表达；用清脂护肝方及Src抑制剂PP2对NASH大鼠进行干预治疗后,我们发现用药组无论是低、中、高剂量组或是PP2组,在抑制Hck、Lyn两种Src相关激酶成员的阳性表达时有显著效果,特别是高剂量组,与模型组比较有统计学意义(P0.01)；模型组SSeCKS蛋白的表达显著低于正常组,在治疗组中的表达介于模型组和正常组,同时伴随Lyn、Hck表达的升高呈减少趋势；且清脂护肝方对Fgr的表达无明显影响,用药前后无统计学意义(P0.05); ELISA:与正常组比较,模型组NASH炎症因子IL-1、IL-6表达有显著统计学意义(P0.01),TNF-α表达有统计学意义(P0.05)；与模型组比较,中、高剂量组IL-1、IL-6表达有显著统计学意义(P0.01),尤以高剂量组明显,TNF-α表达无统计学意义(P0.05)。结论：当炎症刺激时,SSeCKS与Lyn、Hck的表达呈负相关,Lyn与Hck的表达呈正相关；我们推断SSeCKS与Src家族相关激酶(Lyn、Hck)存在某种上下游抑制关系；Fgr与Lyn、Hck家族成员本身可能存在某种竞争抑制作用；提示Src家族相关激酶(Lyn、Hck、Fgr)/SSeCKS分子信号通路参与了NAFLD的发生发展,可作为NAFLD炎症反应的一个潜在调控靶点。清脂护肝方能够调控Hck、Lyn、SSeCKS的表达从而减轻肝脏的炎症反应,是其治疗NAFLD的作用机制之一。
【关键词】：非酒精性脂肪肝病 非酒精性脂肪性肝炎 清脂护肝方 Src抑制剂PP2Src家族相关激酶(Hck、Lyn、Fgr) SSeCKS分子
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.5
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 第一部分 理论研究15-25
• 1. 非酒精性脂肪性肝病的西医现状与进展15-20
• 1.1 定义、分类及流行病学15
• 1.2 病因和发病机制15-16
• 1.3 临床表现及诊断16-18
• 1.4 西医对非酒精性脂肪性肝病的治疗18-20
• 1.5 非酒精性脂肪性肝病的预后20
• 1.6 非酒精性脂肪性肝病的预防20
• 2. 中医学对非酒精性脂肪性肝病的认识20-23
• 2.1 病名及定义的探讨20-21
• 2.2 病因病机的探讨21
• 2.3 辨证论治及分型21-22
• 2.4 中医药治疗非酒精性脂肪性肝病22-23
• 3. 清脂护肝方的相关研究23-24
• 4. Src家族相关激酶(Hck、Lyn、Fgr)/SSeCKS分子的相关研究24-25
• 5. PP2的相关研究25
• 第二部分 实验研究25-52
• 1. 材料25-27
• 1.1 实验动物及细胞25
• 1.2 药品及试剂25-27
• 1.3 主要仪器27
• 2. 方法27-35
• 2.1 人体水平研究27-28
• 2.2 细胞实验28-33
• 2.3 动物实验33-34
• 2.4 统计方法34-35
• 3. 结果35-46
• 3.1 人体水平研究结果35-36
• 3.2 细胞实验36-39
• 3.3 动物实验39-46
• 4. 讨论46-50
• 4.1 Src家族相关激酶(Hck、Lyn、Fgr)的表达46-47
• 4.2 Src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)的表达47-48
• 4.3 关于清脂护肝方的研究48-50
• 4.4 关于PP2的研究50
• 5. 结论50-52
• 参考文献52-56
• 附表56-57
• 攻读硕士学位期间取得的学术成果57-58
• 致谢58

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：766989