稳定表达shRNA的间充质干细胞治疗乙型肝炎肝损伤的研究

发布时间：2017-09-01 13:07

  本文关键词：稳定表达shRNA的间充质干细胞治疗乙型肝炎肝损伤的研究

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【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染使人类患急性或慢性乙型肝炎。急性乙型肝炎一般不会造成严重的肝损伤,绝大多数成年患者的病毒会被自发清除。慢性乙型肝炎会导致肝损伤,甚至会引发肝硬化和肝癌。科学研究发现慢性乙型肝炎引发的肝损伤不是由HBV感染直接引发肝细胞凋亡形成的,而是机体免疫细胞清除被感染的肝细胞时造成的。治疗慢性乙型肝炎的方法主要是药物治疗,目前有两类标准药物。一种是核苷酸类似物,其作用是直接抑制病毒复制,但是停药后易发生复发,长期服用易导致病毒变异产生耐药性。另一种是干扰素类药物,通过调节免疫系统使其清除病毒,但是其价格昂贵且副作用多。并且这两种药物只能抑制病毒复制,无法对已经损伤的肝脏进行修复,并不能有效的治疗慢性乙型肝炎。本文为了在抑制HBV复制的同时对肝损伤进行修复,使用稳定表达短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)的小鼠永生型间充质干细胞(mi MSC)对慢性乙型肝炎肝损伤进行治疗。sh RNA是一种人工的RNA分子,可通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)通路沉默目的基因。HBV基因组是非常合适的RNAi靶点,目前有很多研究表明sh RNA可以有效的抑制HBV复制。然而,对于中后期慢性乙型肝炎患者来说,尽管体内HBV的复制被抑制,但肝损伤程度仍很严重,并且容易引发肝硬化甚至肝癌,因此仅仅抑制HBV复制是不够的,还需要同时治疗肝损伤重建肝功能。研究表明间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植不会引起免疫排斥反应,并且移植后MSCs能向损伤处迁移并分化成为肝细胞样细胞重建肝功能,同时MSCs容易获取,在体内容易增殖。因此MSCs被认为是干细胞移植治疗肝损伤的理想细胞来源。为了评价稳定表达sh RNA的mi MSC(mi MSC-sh RNA)对慢性乙型肝炎肝损伤的疗效,我们需要一种合适的动物模型,由于小鼠免疫系统已经被全面的了解,可以在人工环境下饲养和繁育,体型较小,我们想利用小鼠作为HBV感染损伤的动物模型。但是由于HBV有非常严格的宿主物种限制范围,自然条件下HBV不能感染小鼠肝细胞。因此我们将已成型的两种鼠模型叠加,即尾静脉高压注射法建立的急性乙型肝炎鼠模型和CCl4诱导的肝损伤鼠模型,建立模拟慢性乙型肝炎肝损伤小鼠模型,这样其体内既能模拟HBV的复制又有肝损伤的形成。首先,我们从文献报道中选出两个高效的RNAi靶点,分别是S基因上的157i靶点和X基因上的1694i靶点,并将这两个靶点的序列构建到sh RNA表达载体上得到Hygro-157-1694 sh RNA表达质粒。再将Hygro-157-1694 sh RNA表达质粒转染到含有HBV基因组的Hep G2.2.15细胞中,对该质粒的沉默效率进行评价,发现其可以有效抑制HBV基因组的转录和表达。然后,我们用Hygro-157-1694 sh RNA表达质粒构建了稳定表达sh RNA的mi MSC细胞系,通过体外分化实验证明其具有多种分化潜力,在一定培养条件下可以分化为成骨细胞和肝细胞样细胞,并且这些肝细胞样细胞能表达一些肝细胞特异的蛋白,同时也具有肝细胞的新陈代谢和储存糖原的功能。最后,我们将稳定表达sh RNA的mi MSC细胞系移植到乙型肝炎肝损伤鼠模型体内,通过mi MSC的分化和分泌细胞因子功能对肝损伤进行治疗和肝功能进行重建。另一方面mi MSC及其分化得到的肝细胞样细胞仍能稳定表达sh RNA,防止新生成的肝细胞样细胞被HBV感染,从而提高肝损伤治疗的效率。以达到一次给药却能同时抑制病毒复制、治疗肝损伤重建肝功能的设想。我们通过ELISA法检测模型鼠血浆内乙型肝炎病毒表面抗原(HBs Ag),e抗原(HBe Ag)含量和q RT-PCR法检测模型鼠肝脏HBV S基因的m RNA含量,发现稳定表达sh RNA的mi MSC细胞系对血清内表面抗原和e抗原的表达没有抑制效果,但其可以降低肝脏内S基因的m RNA含量。另外我们通过检测模型鼠血清内谷丙转氨酶,谷草转氨酶含量;模型鼠肝重体重比;天狼星红法对治疗后小鼠肝脏切片染色三种方法评价稳定表达sh RNA的mi MSC细胞系对模型鼠的肝损伤治疗效果,发现其可以有效的治疗肝损伤恢复肝功能。本文通过以上实验证明了稳定表达sh RNA的mi MSC细胞系可以在一定程度上抑制乙型肝炎肝损伤模型鼠肝内HBV的转录,同时对肝损伤的治疗和肝功能的恢复都有良好的疗效,本文为治疗慢性乙型肝炎肝损伤提供了新的思路。
【关键词】：乙型肝炎病毒 肝损伤 短发夹RNA 间充质干细胞
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62;R575
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 第1章 前言13-24
• 1.1 HBV概述13-18
• 1.1.1 HBV基因组和病毒颗粒结构13-15
• 1.1.2 HBV复制过程15-16
• 1.1.3 HBV感染动物模型16-18
• 1.1.4 HBV感染引发的肝损伤形成机制18
• 1.1.5 慢性乙型肝炎治疗进展18
• 1.2 短发夹RNA概述18-20
• 1.2.1 shRNA用于治疗乙型肝炎研究进展18-19
• 1.2.2 shRNA作用机制19-20
• 1.3 MSCs概述20-22
• 1.3.1 肝细胞样细胞的鉴定方法21
• 1.3.2 MSCs治疗肝损伤的机制21-22
• 1.4 本文的立题依据22-24
• 第2章 实验材料和方法24-35
• 2.1 材料与试剂24-25
• 2.1.1 工具酶24
• 2.1.2 菌株和细胞24
• 2.1.3 试剂盒24-25
• 2.1.4 主要试剂25
• 2.1.5 试剂配制方法25
• 2.2 主要仪器25-26
• 2.3 实验方法26-35
• 2.3.1 细胞培养及转染26
• 2.3.2 稳定表达细胞系构建及单克隆筛选26-28
• 2.3.3 Western blot28-29
• 2.3.4 miMSC向成骨细胞分化29
• 2.3.5 茜素红染色29
• 2.3.6 miMSCs向肝细胞分化29-30
• 2.3.7 RT-PCR30-32
• 2.3.8 糖原染色32
• 2.3.9 尿素含量检测32
• 2.3.10 miMSC移植治疗模拟乙型肝炎肝损伤鼠模型32
• 2.3.11 小鼠脾内移植miMSC32-33
• 2.3.12 血清处理方法33
• 2.3.13 ELISA法33
• 2.3.14 AST、ALT含量的测定33
• 2.3.15 冷冻切片33-34
• 2.3.16 天狼星红染色34-35
• 第3章 结果与讨论35-53
• 3.1 miMSC-sh RNA的构建及鉴定35-40
• 3.1.1 慢病毒系统构建miMSC-shRNA35-36
• 3.1.2 Hygro1571694质粒构建及沉默效率检测36-38
• 3.1.3 Hygro质粒系统构建miMSC-shRNA及沉默效率检测38-40
• 3.2 miMSC-sh RNA的体外分化及检测40-47
• 3.2.1 向成骨细胞分化41-42
• 3.2.2 向肝细胞分化42-46
• 3.2.3 miMSC-shRNA向肝细胞分化后抑制HBV复制检测46-47
• 3.3 miMSC-sh RNA治疗乙型肝炎肝损伤小鼠模型47-53
• 3.3.1 miMSC-shRNA2移植抑制HBsAg和HBeAg的表达48
• 3.3.2 miMSC-shRNA2移植降解小鼠肝脏内S基因的mRNA48-49
• 3.3.3 肝重/体重49-50
• 3.3.4 ALT、AST检测50-51
• 3.3.5 天狼星红染色51-53
• 第4章 讨论53-55
• 参考文献55-61
• 致谢61-62
• 作者简介62

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