新型肝炎病毒感染体系构建及抗病毒先天免疫应答研究

发布时间：2017-09-01 15:36

  本文关键词：新型肝炎病毒感染体系构建及抗病毒先天免疫应答研究

  更多相关文章： HCV HBV HLCZ01 先天免疫反应 细胞凋亡 ISG12a miR-942

【摘要】：全球有超过5亿人口属于丙型肝炎病毒(HCV)和/或乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染人群,这些感染者有可能逐步发展为慢性肝炎、肝硬化和肝癌。因缺少理想的病毒感染体系而制约了病毒生活周期、先天免疫反应以及发病机制的相关研究,从而阻碍了研发抗病毒药物的进程。尽管乙肝病毒的预防性疫苗早已上市,HCV疫苗却还未研发成功。相比于其它大部分的病毒感染,HCV感染的主要特征是极易形成慢性感染(约80%)。另一方面,约有20%的HCV感染者能够自动清除体内病毒而不需要接受治疗,表明宿主的先天免疫反应可以控制病毒感染。在病毒感染过程中,诱导I型干扰素和干扰素刺激基因(ISGs)是宿主抵御病毒的主要方式。宿主通过模式识别受体(PRRs)捕获病毒感染所形成的病原体相关分子模式(PAMPs),激活先天免疫应答系统。主要的PRRs包括RIG-I样受体(RLRs)、Toll样受体(TLRs)、Nod样受体(NLRs)和蛋白激酶R(PKR)。然而,HCV和肝细胞抗病毒先天免疫反应之间的复杂相互作用机制未知。本研究工作旨在研发一个理想的HCV和HBV感染细胞培养体系,并基于此体系探究宿主应答病毒感染的先天免疫机制。第一,我们成功分离了一株新型肝癌细胞系HLCZ01。该细胞系来源于一位患有高分化肝癌的男性病人的肝组织。HLCZ01细胞的形态酷似人正常原代肝细胞(PHH),并表达多种肝细胞特异性标志物,包括白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肝细胞核因子4(HNF4)、细胞色素CYP3A4和mi R-122。同时,HLCZ01细胞还表达HCV的四种受体,分别为CD81、SR-BI、CLDN1和OCLN。第二,HLCZ01细胞系支持HCV和HBV感染的完整生活周期。HLCZ01细胞既支持实验室来源和临床病人血清中的HCV感染和复制,又支持体外来源的和体内病人血清来源的HBV感染和复制。从病毒感染的HLCZ01细胞中组装和释放的HBV和HCV可以再感染原始的HLCZ01细胞。HLCZ01细胞支持HBV和HCV共感染,并且这两种肝炎病毒在HLCZ01细胞中的复制互不干扰。抗HBs Ag和抗CD81特异性抗体可分别阻断HBV和HCV入侵HLCZ01细胞。已开发的抗病毒药物可有效抑制HBV和HCV在HLCZ01细胞中的复制。HLCZ01是世界首例支持HBV和HCV病人血清直接感染以及HBV/HCV共感染的肝癌细胞系,这株细胞系可应用于肝炎病毒生活周期、肝细胞与肝炎病毒相互作用的研究以及抗病毒药物和疫苗的研发。第三,HLCZ01细胞和PHH具有完整的先天免疫应答系统。一方面,HCV感染肝细胞后可诱导IFN-β和G1P3、ISG12a以及1-8U等抗病毒ISGs的表达。在HLCZ01细胞中,HBV的存在并不影响HCV诱导IFN-β和ISGs的产生。另一方面,HCV感染HLCZ01细胞和PHH至相对较长时间点时,可诱导病毒感染细胞凋亡,这可能是宿主细胞清除病毒的另一种先天免疫应答方式。在肝细胞中沉默TRAIL可抑制HCV诱导的细胞凋亡。RIG-I缺失可下调IFN-β和TRAIL的表达,并阻断病毒诱导的细胞凋亡,从而促进病毒复制。IRF3是RIG-I的下游信号分子,同样参与了TRAIL介导的肝细胞凋亡。第四,mi R-942通过调控ISG12a表达以介导HCV诱导的细胞凋亡。借助于HLCZ01细胞感染体系,找到了介导HCV所致细胞凋亡的重要调控分子ISG12a及其参与HCV诱导细胞凋亡的信号通路。经生物信息学方法预测和实验验证显示,mi R-942是ISG12a的负调控因子。HCV感染可下调mi R-942的表达,并且mi R-942与ISG12a在HCV感染的肝细胞和肝组织中的表达呈负相关性。过表达或沉默mi R-942可分别减弱或增强HCV诱导的细胞调亡。同时,促凋亡蛋白Noxa在HCV感染细胞中被诱导表达,诱导的Noxa可介导ISG12a依赖的肝细胞凋亡。综上所述,本研究工作构建了一株支持HCV和HBV完整生活周期的新型肝癌细胞系HLCZ01。借助于该感染体系,初步揭示了若干宿主应答病毒感染的先天免疫反应节点。RIG-I通路在HCV感染诱导I型干扰素产生和引发TRAIL介导的病毒感染细胞凋亡途径中起关键作用。mi R-942通过调控ISG12a表达可介导Noxa依赖的HCV所致细胞凋亡。
【关键词】：HCV HBV HLCZ01 先天免疫反应 细胞凋亡 ISG12a miR-942
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.6
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文缩写10-15
• 第1章 绪论15-36
• 1.1 肝炎病毒概述15-22
• 1.1.1 丙型肝炎病毒的基本特征15-19
• 1.1.2 乙型肝炎病毒的基本特征19-22
• 1.2 肝炎病毒感染模型简介22-26
• 1.2.1 细胞培养模型22-24
• 1.2.2 动物模型24-26
• 1.3 模式识别受体简介26-30
• 1.3.1 RIG-I样受体26-28
• 1.3.2 Toll样受体28-29
• 1.3.3 其它模式识别受体29-30
• 1.4 抗病毒天然免疫蛋白30-32
• 1.5 病毒免疫逃逸机制32-35
• 1.5.1 病毒因素32-34
• 1.5.2 宿主因素34-35
• 1.6 本论文的设计思路35-36
• 第2章 新型肝癌细胞系HLCZ01的分离与鉴定36-47
• 2.1 前言36
• 2.2 实验材料36-37
• 2.2.1 材料与试剂36-37
• 2.2.2 仪器设备37
• 2.3 实验方法37-43
• 2.3.1 体外分离和培养原代肝癌细胞37-38
• 2.3.2 小鼠成瘤实验38
• 2.3.3 Western Blot实验步骤38-39
• 2.3.4 Immunofluorescence实验步骤39-40
• 2.3.5 Real-time PCR实验步骤40-42
• 2.3.6 统计学分析42-43
• 2.4 结果与讨论43-46
• 2.4.1 HLCZ01细胞具有肝细胞特征43-44
• 2.4.2 HLCZ01细胞表达HCV受体44-46
• 2.5 小结46-47
• 第3章 HLCZ01支持HCV和HBV感染的完整生活周期47-79
• 3.1 前言47-48
• 3.2 实验材料48
• 3.2.1 材料与试剂48
• 3.2.2 仪器设备48
• 3.3 实验方法48-53
• 3.3.1 HBV感染方法48-49
• 3.3.2 HCV感染方法49
• 3.3.3 HBV和HCV sera感染方法49-50
• 3.3.4 ELISA检测HBV病毒蛋白50
• 3.3.5 Southern Blot实验步骤50-51
• 3.3.6 Northern Blot实验步骤51
• 3.3.7 Lamivdine动物实验51
• 3.3.8 流式细胞仪检测病毒感染细胞51-52
• 3.3.9 免疫电镜52
• 3.3.10 Western Blot实验步骤52
• 3.3.11 Immunofluorescence实验步骤52
• 3.3.12 Real-time PCR实验步骤52-53
• 3.3.13 统计学分析53
• 3.4 结果与讨论53-78
• 3.4.1 HLCZ01细胞支持HCV感染53-60
• 3.4.2 HLCZ01细胞支持HBV感染60-74
• 3.4.3 HLCZ01细胞支持HCV和HBV共感染74-78
• 3.5 小结78-79
• 第4章 HCV诱导HLCZ01和PHH产生有效的先天免疫应答79-98
• 4.1 前言79
• 4.2 实验材料79-80
• 4.2.1 材料与试剂79-80
• 4.2.2 仪器设备80
• 4.3 实验方法80-83
• 4.3.1 HCV感染方法80
• 4.3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡80-81
• 4.3.3 Western Blot实验步骤81
• 4.3.4 过表达和沉默载体构建81
• 4.3.5 Immunofluorescence实验步骤81
• 4.3.6 Real-time PCR实验步骤81-82
• 4.3.7 统计学分析82-83
• 4.4 结果与讨论83-96
• 4.4.1 HCV感染HLCZ01和PHH可诱导IFN-β和ISGs表达83-87
• 4.4.2 HCV诱导HLCZ01和PHH细胞凋亡87-90
• 4.4.3 TRAIL介导HCV诱导的肝细胞凋亡90-92
• 4.4.4 HCV诱导的先天免疫应答依赖于RIG-I通路92-96
• 4.5 小结96-98
• 第5章 MIR-942通过调控ISG12A表达以介导NOXA依赖的HCV所致细胞凋亡98-110
• 5.1 前言98
• 5.2 实验材料98-99
• 5.2.1 材料与试剂98-99
• 5.2.2 仪器设备99
• 5.3 实验方法99-101
• 5.3.1 HCV感染方法99
• 5.3.2 流式细胞仪检测细胞凋亡99
• 5.3.3 过表达和沉默载体构建99-100
• 5.3.4 双荧光素酶报告基因检测100
• 5.3.5 Western Blot实验步骤100
• 5.3.6 Immunofluorescence实验步骤100
• 5.3.7 Real-time PCR实验步骤100-101
• 5.3.8 统计学分析101
• 5.4 结果与讨论101-108
• 5.4.1 ISG12a介导HCV诱导的肝细胞凋亡101-102
• 5.4.2 MiR-942靶向于ISG12a以调控HCV诱导的肝细胞凋亡102-105
• 5.4.3 ISG12a调控HCV诱导的肝细胞凋亡依赖于Noxa105-108
• 5.5 小结108-110
• 结论110-112
• 参考文献112-133
• 附录A 攻读学位期间所发表的学术论文133-135
• 附录B 攻读学位期间所申请的发明专利135-136
• 致谢136-137

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