丙型肝炎病毒调控外周血单核细胞中髓源性抑制细胞的产生及机制研究

发布时间：2017-09-08 02:26

  本文关键词：丙型肝炎病毒调控外周血单核细胞中髓源性抑制细胞的产生及机制研究

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【摘要】：背景:丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染是全球性的严重的社会和公共卫生问题之一。在急性HCV感染人群中,大约80%将会发展成为慢性丙型肝炎,并最终发展为肝硬化和肝癌。HCV感染的慢性化及其逃避宿主免疫清除的机制一直是研究的热点和难点。HCV慢性感染与细胞或体液免疫功能低下或缺失有关,导致机体不能有效清除病毒,从而形成慢性感染,尤其T细胞功能异常在HCV慢性感染中发挥重要的作用。髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是骨髓来源的一群异质性细胞,具有抑制T细胞应答的功能。目前关于MDSCs的研究主要集中在肿瘤,其与肿瘤的侵袭、转移和远期预后有关,而且,MDSCs被认为在肿瘤逃避机体免疫监控方面起着重要作用。MDSCs机制的研究亦集中在其对T细胞功能的抑制方面。MDSCs与HCV感染的相关性研究,仅有很少的文献报道,且结论存在争议。HCV能否以及如何诱导MDSCs产生尚不完全清楚。因此,本研究拟探讨HCV能否从外周血单核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中诱导出MDSCs,以及诱导产生的机制。为HCV感染慢性化机制的阐明提供重要的理论依据,靶向MDSCs的产生可能开启一个治疗HCV持续感染的新手段。目的:1.研究HCV能否从PBMCs中诱导出MDSCs;2.探讨HCV调控MDSCs产生的机制。内容与方法:1.通过免疫磁珠分选等方法从健康供血者外周血浓缩淋巴细胞中分离出新鲜CD14+PBMCs,HCV核心蛋白(HCV core protein,HCVc)和多聚肌苷酸胞苷酸(polyinosinic:polycytidylic acid,poly I:C)模拟HCV感染并处理CD14+PBMCs。外周血浓缩淋巴细胞来自长春市中心血站。2.MDSCs的鉴定。用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测细胞的表型,实时定量聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)来检测相关基因的表达(Arg-1,i NOS,IDO),酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测干扰素γ(Interferon-γ,IFN-γ)的分泌,T细胞增殖实验来检测T细胞增殖情况。3.HCV调控MDSCs产生的机制研究。用中和抗体(Anti-Human IL-1β,IL-10,TNF-α,IFN-β,IFN-α)和通路抑制剂(PI3-Kinase Inhibitor,PI3Ki)处理CD14+PBMCs。通过FCM、ELISA和RT-PCR来进行相关检测。结果:1.HCV对MDSCs产生的诱导调节作用。HCVc处理的CD14+PBMCs呈现出CD14+HLA-DR-/low表型,上调IDO表达,并且抑制T细胞增殖。说明我们成功从PBMCs中诱导出MDSCs。同时我们还发现poly I:C抑制HCVc对MDSCs的这种诱导作用。因此,HCV可以调控PBMCs中MDSCs的产生。2.HCV通过PI3K通路和自分泌细胞因子来调控MDSCs的产生。HCVc通过激活PI3K通路诱导IL-10和TNF-α的产生,进而促进MDSCs的产生。poly I:C通过激活PI3K通路诱导I型干扰素的分泌,从而抑制HCVc所诱导的MDSCs产生。3.IL-10在自分泌细胞因子中起着核心调节作用。HCVc和poly I:C通过激活PI3K通路诱导TNF-α,IL-1β,IL-10和I型干扰素的分泌。在这些细胞因子中,TNF-α和IL-1β促进IL-10的产生,IL-10抑制I型干扰素的分泌,反过来,I型干扰素促进IL-10的分泌,IL-10又抑制TNF-α和IL-1β的产生,从而形成一个调节网络,IL-10在其中起着核心调节作用。结论:HCVc可以从PBMCs中诱导出MDSCs,但是poly I:C抑制HCVc的这种诱导作用。HCV通过PI3K通路和自分泌细胞因子来调控MDSCs的产生,在这些自分泌细胞因子中IL-10起着核心调节作用。
【关键词】：丙型肝炎病毒 髓源性抑制细胞 PI3K通路 自分泌细胞因子 IL-10
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.63
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 中英文缩略词对照表11-13
• 第1章 绪论13-15
• 第2章 文献综述15-27
• 2.1 MDSCs生物学特性15-17
• 2.1.1 MDSCs起源15
• 2.1.2 MDSCs亚群和表型15-17
• 2.2 MDSCs免疫抑制机制17-21
• 2.2.1 Arg-1 和iNOS18
• 2.2.2 氧化应激18-19
• 2.2.3 细胞因子19
• 2.2.4 MDSCs与Tregs19-20
• 2.2.5 MDSCs与NK细胞和NKT细胞20-21
• 2.3 MDSCs扩增、活化机制21-22
• 2.3.1 MDSCs扩增机制21
• 2.3.2 MDSCs活化机制21-22
• 2.4 MDSCs与病毒感染22-23
• 2.5 MDSCs与HCV23
• 2.6 耗竭MDSCs的治疗策略23-24
• 2.7 结语24-27
• 第3章 材料与方法27-39
• 3.1 实验材料27-29
• 3.1.1 实验试剂27-28
• 3.1.2 实验设备28-29
• 3.1.3 实验器具29
• 3.2 实验方法29-37
• 3.2.1 主要试剂配制29-30
• 3.2.2 标本来源30
• 3.2.3 PBMCs的分离纯化30
• 3.2.4 CD14+细胞的分离30-31
• 3.2.5 CD4+细胞的分离31
• 3.2.6 细胞培养31
• 3.2.7 细胞冻存31
• 3.2.8 细胞复苏31
• 3.2.9 流式细胞术31-32
• 3.2.10 IFN-α 和IFN-β 的检测32-33
• 3.2.11 TNF-α、IL-1β 和IL-10的检测33-34
• 3.2.12 实时定量PCR34-37
• 3.2.13 T细胞抑制实验37
• 3.3 统计分析37-39
• 第4章 结果与讨论39-59
• 4.1 HCV调控PBMCs中MDSCs的产生39-48
• 4.1.1 实验结果39-45
• 4.1.2 讨论45-47
• 4.1.3 小结47-48
• 4.2 HCV调控MDSCs产生的机制48-53
• 4.2.1 实验结果48-51
• 4.2.2 讨论51-52
• 4.2.3 小结52-53
• 4.3 IL-10在自分泌细胞因子中起核心调节作用53-59
• 4.3.1 实验结果53-56
• 4.3.2 讨论56-57
• 4.3.3 小结57-59
• 第5章 结论59-61
• 本研究的创新与不足61-63
• 参考文献63-77
• 附录77-79
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果79-81
• 致谢81

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