氯美噻唑对小鼠急性酒精性脂肪肝的拮抗作用研究

发布时间：2017-09-09 04:48

  本文关键词：氯美噻唑对小鼠急性酒精性脂肪肝的拮抗作用研究

  更多相关文章： 细胞色素P4502E1 氯美噻唑 Binge drinking 急性酒精性脂肪肝 氧化应激 自噬溶酶体途径

【摘要】：研究目的酒精是一种常见的肝脏毒素,过量的酒精摄入可以导致酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)。ALD是一种逐渐进展的肝脏疾病,包括酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver, AFL)、酒精性肝炎、肝纤维化及肝硬化等多种病理学表型。AFL是ALD早期出现的可逆阶段,被视为对ALD进行防治的最佳干预阶段。细胞色素P4502E1(cytochrome P4502E1,CYP2E1)是CYP450超家族的一员,也是微粒体乙醇氧化酶系统(microsomal ethanol-oxidizing system, MEOS)的主要成员；活化的CYP2E1可以产生大量的活性氧(]cactive oxygen species,ROS)。已有研究证实了CYP2E1在慢性AFL发病中扮演着重要角色,其分子机制包括过氧化物酶体增殖物活化受体αa(peroxisome proliferator-activated receptor-α, PPAR-α)活性降低等因素。酒精对肝脏的损伤受饮酒剂量和饮酒方式等多种因素的影响。Binge drinking是指短时间内摄入大量酒精的饮酒方式,可以导致急性酒精性肝损伤如脂肪肝、肝炎和肝细胞坏死等。流行病学资料表明全球范围内binge drinking的发生率正在逐年增长。以往关于AFL的研究多集中在慢性AFL,而binge drinking诱导的AFL却较少地受到关注。在慢性AFL发病中起关键作用的CYP2E1是否是导致急性AFL发病的关键因素?CYP2E1的抑制剂是否能够拮抗binge drinking导致的急性肝损伤?这些问题仍待解答。本研究拟建立binge drinking诱导的急性AFL小鼠模型,研究CYP2E1特异性抑制剂氯美噻唑(Chlormethiazole, CMZ)对急性AFL的拮抗作用,并从氧化应激、线粒体损伤、肝脏脂肪合成分解代谢相关信号通路等方面进行分子机制探讨。研究方法SPF级雄性昆明小鼠(18-22 g)30只,适应性饲养3天后,随机分成3组(n=10)：对照组,模型组和CMZ/乙醇组。CMZ/乙醇组和模型组小鼠分别给予CMZ(50 mg/kg bw)和等体积的生理盐水；2h后两组小鼠通过灌胃给予3次5 g/kg bw乙醇(25%,w/v,两次之间间隔12 h)诱导急性AFL。对照组小鼠给予等体积无菌生理盐水和等热量／等体积的麦芽糖糊精溶液。末次酒精给予4小时后,摘眼球取血分离血清；随后处死动物,迅速分离肝脏,称重后分割成小块组织,分别用于病理学检测、生化指标测定、western blotting及qRT-PCR分析。通过HE染色、苏丹Ⅲ染色、油红O染色和透射电镜观察肝脏组织病理学变化。通过生化测定试剂盒测定丙氨酸氨基转移酶(alanine transaminase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase, AST)、甘油三酯(triglyceride, TG)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)和血清乙醇的含量；通过ELISA试剂盒测定肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和脂联素的含量；通过western blotting和qRT-PCR技术测定PPAR-α、甾醇调节元件结合蛋白-1(sterol regulatory element-binding protein-1c, SREBP-lc)、磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)等调控脂肪代谢的分子蛋白和mRNA水平。研究结果1.CMZ有效抑制了急性乙醇暴露导致的急性肝损伤：CMZ干预显著抑制了急性乙醇暴露导致的血清转氨酶活性的升高,血清和肝脏TG含量的增加。与模型组小鼠相比,CMZ干预组小鼠血清和肝脏TG含量分别下降了31.86%和52%(P0.05)。病理学检查结果显示模型组小鼠肝细胞中有大量脂肪滴蓄积；CMZ干预组小鼠脂肪滴明显减少。2.CMZ显著地抑制了急性乙醇暴露导致的小鼠肝脏中CYP2E1的活化和氧化应激：与对照组小鼠相比,模型组小鼠肝脏中CYP2E1的蛋白含量以及肝脏MDA和4-HNE的含量均显著增加(P0.05); GSH的含量显著降低(P0.05)。与模型组小鼠相比,CMZ干预组小鼠肝脏CYP2E1的蛋白含量和MDA的含量分别下降了28.94%和37.46%,GSH的含量增加了73.87%(P0.05)。免疫组化结果显示,CMZ干预显著地抑制了肝组织中4-HNE的表达。3.CMZ抑制了急性乙醇暴露导致的线粒体损伤：透射电镜观察结果显示模型组小鼠肝细胞中有大量的脂肪滴；同时肝细胞线粒体发生了肿胀、破碎、溶解。CMZ干预显著地抑制了乙醇导致的肝细胞中脂肪蓄积和线粒体损伤。4.CMZ和急性乙醇暴露对PPAR-a信号通路相关分子表达的影响：与对照组小鼠相比,模型组小鼠肝脏中PPAR-a,乙酰辅酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase, ACOX)和脂肪酸结合蛋白(liver fatty acid-binding protein, LFABP)的mRNA水平分别下降了16.35%,29.39%,和25.97%(P0.05); CMZ干预有效地抑制了PPAR-α和LFABP mRNA水平的降低(P0.05)。与对照组小鼠相比,模型组小鼠肝脏中PPAR-α,ACOX和LFABP的蛋白水平均显著增加(P0.05)；CMZ干预抑制了PPAR-α和LFABP蛋白水平的增加(p0.05)。5.CMZ和急性乙醇暴露对AMPK和乙酰辅酶A羧化酶(acyl-CoA carboxylase, ACC)蛋白水平及其磷酸化水平的影响：与对照组小鼠相比,模型组小鼠肝脏中AMPK、ACC、 p-AMPK、p-ACC的蛋白水平均未发生显著性的变化。与模型组小鼠相比,CMZ干预组小鼠肝脏中p-AMPK和p-ACC的蛋白水平略有下降(P0.05)。6.CMZ干预对调控脂肪合成代谢关键分子的影响：SREBP-1c和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)以及二脂酰甘油酰基转移酶2 (diacylglycerol acyltransferase 2, DGAT2)的蛋白水平,以及SREBP-1c和FAS的mRNA水平均未受到CMZ干预或急性乙醇暴露的影响。7.CMZ和急性乙醇暴露对肝细胞自噬活性的影响：与对照组小鼠相比,模型组小鼠肝脏的LC3-Ⅱ/LC-I比值显著增加(P0.05)：p62蛋白水平显著降低(P0.05)。与模型组小鼠相比,CMZ干预组小鼠p62的蛋白水平进一步下降(P0.05),LC3Ⅱ/LC3I比值也略有下降(P0.05)。8.CMZ和急性乙醇暴露对血清乙醇、TNF-α和脂联素含量的影响：CMZ显著抑制了急性乙醇暴露导致的血清脂联素含量的降低；CMZ对血清乙醇含量无显著影响；CMZ和急性乙醇暴露对血清TNF-α含量未见明显影响。结论1.CMZ能够拮抗急性乙醇暴露导致的小鼠肝内脂肪的蓄积。2.CMZ可能通过抑制CYP2E1的活化而减轻急性乙醇暴露诱导的氧化应激。3.CMZ对急性AFL的拮抗作用可能与其抑制CYP2E1的活性、激活自噬溶酶体途径以及增加脂联素分泌等因素有关。
【关键词】：细胞色素P4502E1 氯美噻唑 Binge drinking 急性酒精性脂肪肝 氧化应激 自噬溶酶体途径
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.5
【目录】：

• 摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 符号说明14-15
• 前言15-18
• 材料与方法18-30
• 结果30-39
• 讨论39-49
• 结论49-50
• 参考文献50-63
• 致谢63-64
• 攻读学位期间发表的学术论文目录64-65
• 学位论文评阅及答辩情况表65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 Susana Llerena;María Teresa Arias-Loste;Angela Puente;Joaquín Cabezas;Javier Crespo;Emilio Fábrega;;Binge drinking: Burden of liver disease and beyond[J];World Journal of Hepatology;2015年27期

2 延华;张粉利;高艳琼;鲁晓岚;罗金燕;;饮酒与酒精性肝病流行病学调查研究[J];陕西医学杂志;2015年07期

3 Elisabetta Ceni;Tommaso Mello;Andrea Galli;;Pathogenesis of alcoholic liver disease:Role of oxidative metabolism[J];World Journal of Gastroenterology;2014年47期

4 贾艳;付怡静;刘晓阳;杨国庆;;我国酒精性脂肪肝病的研究进展[J];胃肠病学和肝病学杂志;2014年04期

5 何艳;徐腾达;王厚力;李涛;吉栩;于学忠;;北京地区急性酒精中毒发病规律研究[J];中国急救医学;2011年09期

6 陈士林;孟晓丹;王炳元;向国卿;;辽宁省部分城市酒精性肝病流行现状调查[J];实用肝脏病杂志;2010年06期

7 季成叶;;我国大学生过量饮酒行为流行现状[J];中国学校卫生;2010年10期

8 Gyongyi Szabo;Shashi Bala;;Alcoholic liver disease and the gut-liver axis[J];World Journal of Gastroenterology;2010年11期

9 延华;鲁晓岚;罗金燕;周小彦;;陕、甘两省酒精性与非酒精性脂肪肝流行病学分析[J];胃肠病学和肝病学杂志;2007年04期

10 ;Ethanol induced mitochondria injury and permeability transition pore opening: Role of mitochondria in alcoholic liver disease[J];World Journal of Gastroenterology;2007年16期

中国重要会议论文全文数据库 前1条

1 高海鹰;牛莉;;氯美噻唑概述[A];2010施慧达杯第十届全国青年药学工作者最新科研成果交流会论文集[C];2010年

，

本文编号：818395