肝肺综合征患者血清调节人LFs肌样分化及增殖、迁移作用的研究

发布时间：2017-09-09 20:23

  本文关键词：肝肺综合征患者血清调节人LFs肌样分化及增殖、迁移作用的研究

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【摘要】：肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)是慢性肝病患者所发生的肺部并发症,常伴随有门肺高压和肺内血管扩张导致的严重低氧血症。肺微血管扩张和再生所导致的气体交换异常是HPS特征性的病理生理改变。HPS常见于肝硬化患者终末期,目前常用动脉血气、增强对比超声心动图、肺灌注扫描和肺血管造影来确诊是否HPS患者肺部存在特征性的肺血管异常。临床上除肝移植外,现无有效治疗肝肺综合征的方法,因此其严重影响患者的生存质量和导致高死亡率。前期研究发现:肺血管重建(pulmonary vascular remodeling,PVR)可能是其主要发病机制之一。其病理生理进程是一个由多种细胞共同参与、相互影响的复杂网络共同作用的结果,非肌性血管部位出现平滑肌样细胞、肌性血管中膜和外膜增厚、内膜斑块形成,致使肺PVR发生;肺动脉平滑肌大量增殖,并从血管中层迁移至血管内膜,使整个肺微血管扩张和重建。肌成纤维细胞(Myofibroblast,MF)是成纤维细胞的特殊分化类型,其超微结构特征介于成纤维细胞和PASMCs之间,是属于PASMCs样细胞中的一种。既往研究认为PASMCs从中膜迁移到内膜大量增殖,其细胞表型也由高分化的收缩型转换为未分化的合成型,PVR的病理变化是血管内膜PASMCs大量堆积所致。然而越来越多的研究发现外膜成纤维细胞、成纤维母细胞在低氧等刺激因素作用下,活化形成MFs,因此我们推测活化的MFs可能迁移至内膜并大量增殖,直接参与PVR内膜大量堆积PASMCs的形成。但是,具体的机制尚不清楚。前期我们已经做了关于肝肺综合征患血清对SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖、迁移及表型转换的影响的相关研究,其结果是肝肺综合征患者血清可促进PASMCs向合成表型的转换,并增强其增殖、迁移能力。由此推测:HPS血清中的细胞因子释放,进入血液循环后达到肺脏,刺激血管外膜LFs(Lungfibroblast.LFs),使LFs增殖迁移和发生肌样分化,最终导致肺血管的病理性重建和HPS的发生发展。本课题通过体外培养成人LFs,模拟生理条件下HPS患者血清对人LFs肌样分化,增殖及迁移变化的影响,探索LFs在HPS患者血管重建中所起到的作用,从而为HPS的防治提供新的靶点。研究内容:1、培养及鉴定人肺原代LFs,原代LFs培养3-4天后传代,运用光镜、免疫荧光染色法进行鉴定。2、肝肺综合征患者血清的收集,按照入选标准筛选合格的HPS患者与健康对照组,并且按要求抽取少量外周血液提取血清。3、分别用正常和肝肺综合征患者血清刺激人LFs,免疫组化检测细胞SM-α-actin的表达情况。4、分别用正常和肝肺综合征患者血清刺激人LFs,Western blot检测其SM-MHC和SM-α-actin蛋白的变化情况。5、分别用正常和肝肺综合征患者血清刺激人LFs,用3H-Td R和transwell法检测各组LFs的增殖和迁移能力。研究结果:1、在倒置显微镜下观察原代培养的人LFs,细胞呈长梭形和针状形态为主,贴壁生长,细胞间界限清楚,立体折光率高,彼此间连接成网状。通过波形蛋白vimentin免疫荧光染色鉴定为LFs。2、肝肺综合征患者血清的收集,-80度冻存待用。3、免疫组化法结果,与正常血清处理组比较,肝肺综合征患者血清组培养细胞呈长梭形,核呈杆状或椭圆状,细胞胞浆有大量棕黄色颗粒沉积。正常者的血清刺激细胞在倒置显微镜下单层贴壁生长,状如梭形或三角形,胞核清晰,胞浆丰富,SM-α-actin免疫化学染色胞内未见明显的棕黄色沉淀。4、western bolt检测显示:实验组SM-α-actin、SM-MHC蛋白表达上调,尤其在48h(T2)和72h(T3)时间点,肝肺综合征血清刺激SM-α-actin、SM-MHC蛋白表达明显增加,呈时间依赖的递增趋势(P0.05),而正常血清组无明显变化。5、3H-Td R检测和transwell检测,与对照组相比,体外实验中,HPS血清使人肺2代LF的迁移、增殖能力增强,尤其是在48h和72h。结论:1、肝肺综合征患者血清促进人LFs体外发生肌样分化。2、肝肺综合征患者血清促进人LFs增殖、迁移能力增加。
【关键词】：人肺成纤维细胞 肝肺综合征患者血清 肌样分化 增殖 迁移
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575;R563
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 肝肺综合征患者血清调节人LFs肌样分化作用的研究13-36
• 2.1 成人LFs的培养和鉴定14-20
• 2.1.1 材料和方法14-16
• 2.1.2 结果16-18
• 2.1.3 讨论18-19
• 2.1.4 小结19-20
• 2.2 肝肺综合征患者血清对人肺LFs肌样分化的影响20-31
• 2.2.1 材料和方法20-28
• 2.2.2 结果28-30
• 2.2.3 讨论30-31
• 2.2.4 小结31
• 2.3 肝肺综合征患者血清对人LFs增值、迁移的影响31-36
• 2.3.1 材料和方法31-33
• 2.3.2 结果33-35
• 2.3.3 讨论35
• 2.3.4 小结35-36
• 全文讨论36-38
• 全文总结38-39
• 参考文献39-45
• 文献综述 成纤维细胞表型转化的相关信号通路的研究进展45-54
• 参考文献51-54
• 攻读学位期间的研究成果54-55
• 致谢55

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本文编号：822578