基于腺相关病毒载体的人工miRNA抗乙型肝炎病毒基因治疗研究

发布时间：2017-09-10 20:15

  本文关键词：基于腺相关病毒载体的人工miRNA抗乙型肝炎病毒基因治疗研究

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【摘要】：乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)引起的传染病。HBV感染是一个非常严重的全球性公共卫生问题,是严重危害人类健康的重大传染病之一。据统计,全球大约有3.5亿慢性HBV感染者,每年全球大约有100万人死于与HBV感染相关的疾病,包括肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌等。中国是乙型病毒性肝炎的高流行地区,人群感染率高,在某些地区感染率高达35%以上,给国家带来沉重的社会经济负担。我国HBV携带者约9300万人,其中慢性乙肝患者高达2500万,是我国最为严重的三大传染病之一,也是我国肝细胞癌(HCC)高发的重要原因。目前临床上对乙肝病毒感染的主要治疗药物包括干扰素、核苷及核苷酸类似物等,但是这些药物只能在少数慢性感染患者中产生长期应答,并不能彻底清除乙肝病毒,并且也存在着复发率高、药物毒副作用较大和药品价格昂贵等问题,因此发展慢性乙肝新的治疗策略仍是医学上面临的巨大挑战。基因治疗作为生物技术新的里程碑,是生物技术产业发展的主方向之一,曾被Science杂志评为2009年10大科学突破之一,而其中值得关注的是,重组腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)载体在治疗先天性黑蒙病中及B型血友病等疾病的基因治疗临床试验中取得了突破性的进展,第一个用于治疗脂蛋白脂酶缺乏遗传病(LPLD)的AAV载体介导的基因治疗药物Glybera已在欧美国家批准上市。AAV以其低致病性、低免疫原性、能导致外源基因长期表达等优点被视为最具有开发潜质的病毒载体之一。而根据多篇文章报道,在众多AAV血清型中,8型腺相关病毒(AAV-8)对肝脏细胞的转导效率较高,是肝脏疾病基因治疗常用载体。miRNA是一类由内源性非蛋白质编码基因转录加工形成的长约21 nt的小分子单链RNA,是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经Dicer酶加工后生成,在动植物中参与转录后基因表达调控。人工miRNA (artificial miRNA, amiRNA)是指将天然miRNA的成熟序列替换为人工设计的靶向某一基因的反义序列,可模拟内源miRNA的作用机制人为地沉默目的基因,由于amiRNA利用了miRNA的天然生成途径,同时相对于shRNA具有干扰效果更好、体内毒性更低等优点而逐渐成为研究的新热点。本课题应用8型腺相关病毒载体携带三个串联表达的amiRNA进行抗HBV的基因治疗研究。本课题第一部分探索了应用肝靶向性较好的AAV-8载体介导3个串联表达的amiRNA对乙肝模型小鼠体内HBV抑制作用的研究。本课题组成员在前期研究中构建了3条靶向不同基因型HBV的基因组保守区并去除任何靶向人和小鼠非特异序列的amiRNA,实验证明其对HBsAg和HBeAg匀有显著的抑制效果且3个串联表达的amiRNA较单个的amiRNA有更高的抑制HBV复制的作用。本研究中,我们构建了携带肝特异性启动子的3个串联amiRNA的rAAV表达质粒并命名为pAAV-liver-amiRNA135,通过将pAAV-liver-amiRNA135与不同基因型HBV表达质粒共转染HepG2细胞,在体外证明其对不同基因型HBV的HBsAg、HBeAg的表达以及HBV DNA的复制均有显著抑制作用(p0.01)。接着,我们将pAAV-liver-amiRNA135包装成与质粒相比对肝脏细胞转导效率更高的重组腺相关病毒载体即AAV8-amiRNA135,然后对其进行药效学评价,为后期较深入的临床前研究和临床研究提供参考。首先,我们利用乙肝病毒低复制转基因小鼠联合水动力注射HBV表达质粒以维持小鼠肝内HBV长期高复制表达的方法构建了肝内HBV高复制的乙肝模型鼠并进行AAV8-amiRNA135的梯度药效学实验。将AAV8-amiRNA135以5×1011vg/只、5×1010vg/只、5×109vg/只、5×108vg/只经尾静脉分别注射模型小鼠,并以注射5×1011vg/只携带不靶向人类及老鼠任何基因的amiRNA序列的AAV8-Neg为阴性对照组,以注射5×1011vg/只携带双荧光素酶基因的AAV8-luc载体为空白对照组,在注射后不同时间点内采静脉血,用定量ELISA方法检测血清中HBsAg及HBeAg的表达水平,结果显示,AAV8-amiRNA135对乙肝模型小鼠血清HBsAg及HBeAg的抑制效果具有剂量依赖性,尤其是注射5×1011vg/只AAV8-amiRNA135的乙肝模型小鼠血清中HBsAg、 HBeAg;表达水平显著下降,甚至接近阴性水平。更重要的是,我们发现单次尾静脉注射AAV8-amiRNA135能有效抑制HBV复制至少15个月。接着,我们通过颈椎脱臼法处死小鼠,提取肝脏组织乙肝病毒核心颗粒DNA来检钡HBV DNA的拷贝数水平,结果显示,肝脏组织中HBVDNA拷贝数随着该病毒载体注射剂量的增大而显著降低(p0.01),说明了amiRNA135的表达能有效抑制肝内HBVDNA的复制。此外,我们对肝脏组织进行了HE染色及针对乙肝表面抗原HBsAg和核心抗原HBcAg的免疫组织化学染色。HE染色结果显示,阴性对照组小鼠肝组织切片可见明显炎症细胞浸润,肝小叶结构紊乱,肝炎病理特征较明显；注射5×109vg AAV8-amiRNA135小鼠肝脏组织与阴性对照组相比,炎症细胞相对较少,有较为整齐的肝小叶结构；注射剂量为5×1010vg及5×1011vgAAV8-amiRNA135的小鼠,肝细胞形态正常,肝小叶排列整齐且无明显炎症细胞浸润,说明注射剂量为5x1010vg及5×1011Vg的AAV8-amiRNA135能有效抑制肝炎反应且无明显肝毒性。通过免疫组织化学染色法检测肝脏组织中HBsAg和HBcAg的表达水平,结果显示,肝脏组织中HBsAg和HBcAgP阳性细胞数均随着AAV8-amiRNA135注射剂量的增大而减少,说明AAV8-amiRNA135对乙肝转基因小鼠肝组织中HBsAg,及HBcAg的表达均有显著抑制作用,且抑制效果具有剂量依赖性。后续随着实验室高复制乙肝转基因小鼠模型的成功构建,我们进一步研究比较了AAV8-amiRNA135对不同品系的高复制乙肝转基因小鼠的抗HBV作用。HBV转基因小鼠选择了三个品系,分别为C16-4♀、2C♂和2B♂、2B♀。将AAV8-amiRNA135以5×10¨vg/只经尾静脉分别注射以上小鼠,以注射5×1011vg/只的AAV8-Neg为阴性对照组,在注射后第1、2、3周采静脉血检测血清中HBsAg及HBeAg的表达水平,结果显示,AAV8-amiRNA135对三个品系的乙肝转基因小鼠均有较好的抑制作用,其对血清中HBsAg的抑制效率均达到80%-90%,对HBeAg的抑制效率也达到40%-70%。注射病毒载体后第4周,通过颈椎脱臼法处死小鼠,对肝脏组织HBV DNA及HBV RNA拷贝数水平进行定量检测,结果显示,注射AAV8-amiRNA135的乙肝转基因小鼠肝组织中HBV DNA及HBV RNA拷贝数均显著低于阴性对照组(p0.05),说明了amiRNA135的表达能有效抑制不同品系乙肝转基因小鼠肝脏组织中HBVDNA及RNA的复制。综上所述,这一部分研究所构建的AAV8-amiRNA135载体对HBV具有广泛而显著的抑制作用,且单次载体灌注能有效发挥抑制作用至少15个月,本研究结果为慢性乙肝的基因治疗开辟了新路径。为进一步提高AAV介导的肝脏疾病基因治疗效率,本课题第二部分和第三部分内容旨在探索肝靶向性更高的重组腺相关病毒载体。在目前发现的众多AAV血清型中,已知AAV-8是肝脏基因治疗最常用的载体之一；AAV-DJ是将8种不同血清型AAV的衣壳基因通过DNA shuffling技术得到的嵌合型AAV载体,具有与AAV-8相同的肝靶向性且人体内存在的AAV抗体对它的中和性较低,因此也被认为是人类肝脏疾病基因治疗理想的载体之一。但尽管如此,AAV在肝脏基因转导的应用还具有一定的挑战性,例如,机体对AAV衣壳蛋白的免疫排斥、泛素蛋白酶体介导的蛋白降解途径均能使AAV在细胞内发生降解,从而降低其介导的基因传递效率。因此,为了降低AAV的免疫源性及胞内降解率,需要进一步优化AAV载体,从而提高其转导效率。据文献报道,对AAV衣壳蛋白表面特定的磷酸化/泛素化残基(如酪氨酸,赖氨酸,丝苏氨酸等)进行突变能进一步提高其转导效率,原因是这些位点突变后能阻断下游的泛素化介导的蛋白降解,从而提高AAV载体介导外源基因在细胞内的表达效率。我们首先利用磷酸化/泛素化位点预测软件,选定了三个AAV8的突变位点和三个AAV-DJ的突变位点,然后利用overlap-PC R方法进行定点突变,构建了三个AAV8的突变体：Y447F、Y703F和Y708F,以及三个AAV-DJ的突变体：K137,T251A, S503A。通过PEI转染法将突变的cap质粒、病毒包装辅助质粒pAAV-Helper及外源基因表达质粒共转染293T细胞,包装成表达GFP基因和/或双荧光素酶Gluc-Fluc基因的重组AAV载体。首先将表达双荧光素酶Gluc-Fluc基因的重组野生型AAV-8及其三个酪氨酸突变体(Y447F、Y703F和Y708F)以1×1010vg注射6-8周龄的C57BL/6小鼠,在注射后第7、14、21、28天取尾静脉血检钡Gluc的表达,结果显示,Y703F突变体介导Gluc的相对表达量在不同时间点均显著高于野生型AAV8约3-4倍(P0.05)。注射42天后麻醉小鼠,利用活体成像方法检测各载体的体内靶向性,结果显示,三种突变体均具有肝靶向性,与野生型AAV-8一致,且Y703F介导的Fluc在肝脏组织中的平均光强度显著高于野生型AAV-8约2倍(P0.01)。活体成像实验后处死小鼠,提取各组织DNA,调整上样DNA模板至相同浓度,用QPCR方法检测Fluc DNA的水平,结果显示,在肝脏组织中,四种载体介导的Fluc DNA拷贝数在106～107GC (genomecopy) /100ng总DNA,而在其他组织,例如肾脏、心脏及肌肉组织,四种载体介导的Fluc的DNA拷贝数则低至105～106GC/100ng ,总DNA,进一步说明了三个酪氨酸突变体的肝靶向性没有改变,而且Y703F突变体介导的Fluc对小鼠肝脏、肾脏及肌肉的转导效率均高于野生型AAV-8约3-7倍(P0.01)。为了进一步验证该突变体的有效性,我们还比较了携带治疗性基因血管紧张素1-7 (Angiotemin 1-7 ,Ang (1-7))的wtAAV-8及其Y703F突变体在C57BL/6小鼠体内的转导效率,将两种病毒以1×1011vg经尾静脉分别注射小鼠,以注射1×1011vg Y703F-Luc为阴性对照组,在注射后第7,14,21,28天检测血清中Ang(1-7)的表达水平,结果显示,Y703F介导的Ang(1-7)表达水平从第14天开始显著高于wtAAV-8约2倍(p0.01)；肝组织DNA拷贝数分析结果显示,Y703F介导的Ang(1-7)在肝脏的DNA拷贝数显著高于wtAAV-8约3倍(p0.001)。因此我们得出,对AAV-8衣壳蛋白703位点上的酪氨酸残基进行突变能有效提高其对肝脏的转导效率,且该突变体具有与wtAAV-8相一致的肝靶向性。同样地,我们将表达双荧光素酶Gluc- F luc基因的AAV-DJ及其三个突变体(K137R, T251A, $503A)以l×1011vg注射6-8周龄的C57BL/6小鼠,在注射后第7、14、21、28天取尾静脉血检钡Gluc的表达,结果显示,S503A突变体介导Gluc的相对表达量在不同的时间点均高于AAV-DJ约3倍(P0.01)。注射42天后麻醉小鼠,利用活体成像方法检测各载体的体内靶向性,结果显示,三种突变体均具有肝靶向性,与AAV-DJ一致。活体成像实验后处死小鼠,提取各组织DNA,调整上样DNA模板至相同浓度,用QPCR方法检钡Fluc DNA的水平,结果显示,在肝脏组织中,四种载体介导的Fiuc的DNA拷贝数在107～108 GC/100ng总DNA,而在肾脏、心脏、胰脏、肺、脑及肌肉组织,四种病毒载体介导的Fluc的DNA拷贝数则低至105～107 GC/100ng总DNA,进一步说明了三个突变体仍保持肝靶向性,而且S503A突变体介导的Fluc对小鼠肝脏、心脏及肌肉的转导效率均显著高于AAV-DJ约3倍(P0.05)。然而,在体外实验中,我们将表达GFP基因的AAV-DJ及其三个突变载体以MOI=1000感染三种不同类型的细胞：293T、Hela和HepG2细胞,感染后48h检测四种病毒载体介导GFP对三种不同细胞系的转导效率,结果显示,K137R和S503A突变体介导的GFP对三种细胞的转导效率稍高于AAV-DJ约20%-30%(p0.05),而T251A突变体则无明显差异。因此我们得出,虽然体外感染效率只有稍微的提高,但AAV-DJ衣壳蛋白503位点上的丝氨酸残基进行突变能够有效提高其对小鼠体内肝脏、心脏及肌肉的转导效率,具有重要应用意义。综合本课题的三部分研究内容,我们主要取得了以下成果：1、本研究所研发的AAV8-amiRNA具有自主知识产权,实验证明该候选药物能在乙肝模型动物体内持续稳定地表达,从而达到长期稳定抑制HBV复制的作用。利用AAV-8作为载体携带3个串联表达的amiRNA在乙肝转基因小鼠体内表达,能有效抑制小鼠血清中HBsAg, HBeAg水平并显著降低肝脏HBsAg、HBcAg的表达水平以及HBVRNA, DNA的拷贝数；一次尾静脉注射能稳定发挥抑制作用至少15个月；对不同品系乙肝转基因小鼠均具有广泛而显著的抑制作用,该候选药物为乙肝的基因治疗开辟了新路径；2、通过overlapping-PCR方法对AAV-8衣壳蛋白进行单点突变,构建了三个AAV8的酪氨酸突变体(Y447F、Y703F、Y708F),体内结果显示,Y703F突变能显著提高其对小鼠肝脏、肾脏及肌肉的转导效率且具有与wtAAV-8一致的肝靶向性；3、同样方法构建了三个AAV-DJ的突变体(K137R、 T251A, S503A),虽然体外结果显示四个病毒载体对293T、Hela及HepG2细胞的感染效率差异较小,但体内结果显示,S503A突变能显著提高其对小鼠肝脏、心脏及肌肉的转导效率,且同样具有较好的肝靶向性。以上结果为肝脏疾病的基因治疗提供新线索。
【关键词】：重组腺相关病毒载体 点突变 人工miRNA 乙肝 基因治疗
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62;R450
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-34
• 参考文献27-34
• 第一章 AAV8介导amiRNA抑制乙肝转基因小鼠体内HBV复制34-68
• 1.1 实验材料35-37
• 1.2 实验方法37-47
• 1.3 统计学分析47-48
• 1.4 实验结果48-63
• 1.5 讨论63-65
• 1.6 参考文献65-68
• 第二章 衣壳蛋白表面磷酸化位点突变提高AAV-8的体内转导效率68-91
• 2.1 实验材料69-70
• 2.2 实验方法70-78
• 2.3 统计学分析78
• 2.4 实验结果78-86
• 2.5 讨论86-88
• 2.6 参考文献88-91
• 第三章 衣壳蛋白表面磷酸化位点突变提高AAV-DJ的体内转导效率91-113
• 3.1 实验材料91-93
• 3.2 实验方法93-101
• 3.3 统计学分析101
• 3.4 实验结果101-109
• 3.5 讨论109-111
• 3.6 参考文献111-113
• 全文总结113-115
• 攻读学位期间发表的论文115-116
• 英文缩写116-117
• 致谢117-118

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本文编号：826400