肝脏脂质代谢障碍中SIRT6相关分子的组学研究

发布时间：2017-09-12 13:04

  本文关键词：肝脏脂质代谢障碍中SIRT6相关分子的组学研究

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【摘要】：背景:研究发现Sir2蛋白能够通过卡路里限制的途径延长线虫等低等生物的寿命,这一过程主要是通过Sir2蛋白的去乙酰化作用实现的。哺乳动物中和Sir2蛋白同源的Sirtuins家族也是一组具有去乙酰化活性的蛋白。其家族成员之一SIRT6,通过去乙酰化作用在生理状态下可促进机体维持正常的染色体结构与功能,并以此来调节糖脂代谢、抗衰老等。然而,利用组学研究大规模筛选SIRT6相关分子在肝脏糖脂代谢调节中的作用目前研究甚少。本课题重点在于通过蛋白组学挖掘SIRT6相互作用分子及转录组学筛选受其调控的下游分子,来探究受SIRT6影响的哪些分子在调控肝脏糖脂代谢过程中发挥显著作用,以及其发挥作用的具体机制,从而为解释非酒精性脂肪性肝病的发生发展提供新的观点和科学依据。目的:1.建立SIRT6高低表达的L02细胞系及构建SIRT6肝脏特异性敲除小鼠模型。2.SIRT6相互作用分子筛选及鉴定。3.筛选SIRT6调控的差异表达基因。方法:1.利用慢病毒转染构建L-02 SIRT6-Flag细胞系;利用TALEN敲除系统构建L-02 SIRT6-KO细胞系;通过油红O染色、高内涵荧光染色实验观察L-02SIRT6-KO细胞成脂能力;通过基因敲除技术Cre-loxp系统,构建SIRT6肝脏特异性敲除小鼠;通过DNA琼脂糖凝胶电泳、Western-Blot鉴定小鼠基因型;建立小鼠NAFLD模型,利用小鼠肝脏HE染色来观察小鼠肝脏脂肪变的程度,通过免疫组化实验来验证受SIRT6调控的下游相关分子的表达水平。2.通过免疫共沉淀技术对SIRT6的相互作用分子进行富集;利用Label-free蛋白质组学非标记定量技术对富集分子进行筛选和鉴定;通过生物信息学分析,建立SIRT6相关作用分子调控网络。3.利用高通量基因芯片技术进行差异转录基因筛选;通过q RT-PCR及Western-Blot来对差异转录分子进行验证,利用i TRAQ蛋白质定量技术筛选差异表达蛋白,利用GO及KEEG对差异转录基因及蛋白进行信号通路分析。结果:1.成功建立L-02 SIRT6-Flag细胞系及L-02 SIRT6-KO细胞系;细胞成脂能力实验显示,L-02 SIRT6-KO细胞系其脂滴形成能力高于对照组,高内涵荧光检测系统发现L-02 SIRT6-KO细胞其脂滴荧光强度高于对照组。利用Alb-Cre小鼠成功建立肝脏SIRT6特异性敲除小鼠。2.通过免疫共沉淀实验及Label-free蛋白质组学非标记定量技术,筛选到一组可能和SIRT6发生相互作用的相关分子;利用免疫共沉淀技术进行相互作用分子验证,发现GFAT1等分子很可能是SIRT6相关作用分子。3.利用基因芯片技术筛选到一组差异基因,并进行q RT-PCR以及Western-Blot验证;发现STEAP4、CEBPA、KYNU、PDE1A、HMGA2等和糖脂代谢相关分子。利用i TRAQ蛋白质定量技术筛选差异表达蛋白,两者联合分析结论:1.首次建立人肝脏SIRT6稳定敲除细胞系,并经功能实验实验证明SIRT6缺失能够促进脂滴形成。肝脏SIRT6特异性敲除小鼠的建立为研究SIRT6相关的脂质代谢提供NAFLD模型。2.发现一组SIRT6相互作用分子如G3BP1、GFAT1、COASY、PARP1等,不仅发现前人报导的SIRT6相互作用分子如G3BP1,而且发现了一批新的分子如GFAT1、COASY.3.筛选到一组和SIRT6相关参与脂质代谢的关键基因。发现其参与多条与SIRT6相关的信号通路。
【关键词】：SIRT6 蛋白组学 NAFLD 转录组学 脂代谢
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.5
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 文献回顾15-22
• 第一部分 建立SIRT6高低表达的L02细胞系及构建SIRT6肝脏特异性敲除小鼠模型22-36
• 1 材料22-23
• 2 方法23-30
• 3 结果30-35
• 4 讨论35-36
• 第二部分 SIRT6相互蛋白分子的筛选与鉴定36-48
• 1 材料36
• 2 方法36-39
• 3 结果39-46
• 4 讨论46-48
• 第三部分 SIRT6相关的差异表达基因的筛选48-55
• 1 材料48
• 2 方法48-50
• 3 结果50-53
• 4 讨论53-55
• 小结55-56
• 参考文献56-61
• 附录61-66
• 个人简历和研究成果66-67
• 致谢67

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本文编号：837366