骨髓间充质干细胞移植治疗溃疡性结肠炎及复方苦参汤的协同作用研究

发布时间：2017-09-15 16:10

  本文关键词：骨髓间充质干细胞移植治疗溃疡性结肠炎及复方苦参汤的协同作用研究

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【摘要】：第一部分骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定 目的：全骨髓贴壁法体外分离培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞,为后续实验打下基础。 方法：取4周龄SD大鼠,体外分离培养骨髓间充质干细胞,经连续传代纯化,流式细胞术进行鉴定。 结果：骨髓间充质干细胞呈成纤维细胞样形态,梭形或纺锤形,漩涡状或辐射状排列,P3代及以后的细胞形态均一,生长旺盛,无明显衰老现象。BMSCs高表达CD29. CD90,而不表达造血干细胞的表面标记CD45, CD11b。 结论：全骨髓贴壁法体外分离培养的骨髓间充质干细胞形态均匀、状态稳定,纯度高,形态学及流式细胞学鉴定符合间充质干细胞特点。 第二部分BMSCs移植治疗溃疡性结肠炎大鼠的实验研究及复方苦参汤的干预 目的：BMSCs移植及复方苦参汤干预后,观察实验大鼠疾病活动指数(disease activity index, DAI),结肠病理组织学改变并评分。 方法：8周龄清洁级SD大鼠,采用2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)构建溃疡性结肠炎模型；慢病毒(Lentiviral Vector, LV)介导绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)转染BMSCs;标记后的BMSCs于造模后进行移植,同时以复方苦参汤灌胃干预；免疫荧光组化及weston blot检测结肠组织GFP表达,对各组大鼠进行疾病活动指数(DAI)评估,并观察结肠组织病理学改变进行评分。 结果：1、BMSCs移植及复方苦参汤干预2w后,免疫荧光组化及weston blot显示,BMSCs组和二联组结肠炎性受损区可见GFP表达；2、与空白组相比,PBS组的DAI评分显著上升,与PBS组相比,BMSCs组和二联组能够下降DAI分数(P0.05);3、与空白组相比,PBS组的组织病理学评分显著增加,与PBS组相比,BMSCs组及二联组的评分下降(P0.05)。 结论：BMSCs和复方苦参汤干预后结肠炎大鼠症状得到了明显的缓解,结肠组织受损得到修复。 第三部分BMSCs治疗溃疡性结肠炎的免疫机制研究 目的：研究BMSCs治疗溃疡性结肠炎的相关免疫作用机制 方法：体外分离培养BMSCs,流式细胞术进行鉴定,LV-GFP转染BMSCs进行标记,TNBS诱导溃疡性结肠炎动物模型,实验分为四组：空白组,PBS组,BMSCs组,BMSCs组+中药组。PBS/BMSCs经尾静脉移植,BMSCs组+中药组予复方苦参汤灌胃干预,流式细胞术检测大鼠外周血Treg表达,ELISA检测大鼠血清TNF-a表达,Western blot检测细胞质及细胞核NF-κBp65表达,RT-PCR检测大鼠肠黏膜Foxp3mRNA TNF-αmRNA的表达。 结果：1、和空白组相比,PBS组外周血Treg比率明显下降;干预后,和PBS组相比,BMSCs和二联组Treg比率上升(P0.05)。2、和空白组相比,PBS组Foxp3mRNA表达明显上升;干预后,和PBS组相比,BMSCs和二联组Foxp3mRNA表达下降(P0.05)。3、和空白组相比,PBS组胞质及胞核NF-k Bp65表达升高；干预后,和PBS组相比,BMSCs和二联组胞质及胞核NF-k Bp65表达下降(P0.05)。4、和空白组相比,PBS组TNF-a表达升高；干预后,和PBS组相比,BMSCs和二联组TNF-a表达明显下降(P0.05)。 结论：BMSCs可以有效缓解溃疡性结肠炎,机制可能与BMSCs重新调配外周血和肠黏膜之间的Γreg比例,以及调控NF-kB介导的促炎反应相关,同时复方苦参汤起到协同作用。
【关键词】：全骨髓贴壁法 骨髓间充质干细胞 传代 LV-GFP TNBS DAI 组织病理学 BMSCs 复方苦参汤 Treg NF-κB TNF-α
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R574.62
【目录】：

• 英文缩略词表8-11
• 研究背景11-13
• Background13-15
• 中文摘要15-18
• Abstract18-22
• 第一部分 BMSCs的体外分离、培养及鉴定22-35
• 前言22
• 材料和方法22-27
• 一、实验材料22-24
• 二、实验方法24-27
• 实验结果27-29
• 一、骨髓间充质干细胞的形态学观察27-28
• 二、骨髓间充质干细胞的流式鉴定28-29
• 讨论29-32
• 参考文献32-35
• 第二部分 BMSCs移植治疗溃疡性结肠炎大鼠的实验研究及复方苦参汤的干预35-55
• 前言35-36
• 材料和方法36-44
• 一、实验材料36-37
• 二、实验方法37-44
• 实验结果44-48
• 一、动物模型评估及DAI评分44-45
• 二、追踪体内干细胞45-46
• 三、组织病理学观察46-47
• 四、组织病理学评分47-48
• 讨论48-51
• 参考文献51-55
• 第三部分 BMSCs治疗溃疡性结肠炎的免疫机制研究55-82
• 前言55
• 材料和方法55-65
• 一、实验材料55-57
• 二、实验方法57-65
• 实验结果65-70
• 一、实验大鼠外周血CD4~+D25~+Foxp3~+Treg细胞表达65-67
• 二、大鼠血清TNF-Q表达67-68
• 三、细胞质及细胞核NF-κ Bp65表达68-69
• 四、实验大鼠结肠黏膜Foxp3、TNF-α mRNA表达69-70
• 讨论70-76
• 参考文献76-82
• 综述82-90
• 参考文献86-90
• 附件一 攻读学位期间发表论文90-91
• 附件二 攻读学位期间参与科研课题91-92
• 致谢92

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本文编号：857537