采用新一代测序技术分析不同感染阶段乙型肝炎病毒准种异质性及其临床意义

发布时间：2017-09-16 01:27

  本文关键词：采用新一代测序技术分析不同感染阶段乙型肝炎病毒准种异质性及其临床意义

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【摘要】：背景与目的本课题组之前采用克隆测序(CBS)的方法研究发现乙型肝炎病毒(HBV)逆转录酶区(RT区)准种异质性可作为接受核苷类似物治疗患者抗病毒疗效的一个预测指标。近年来,第二代测序技术(NGS)以其相对快速、超深度、高灵敏度的特点给HBV准种研究带来了新的策略。目前对于HBV感染后不同临床阶段的病毒全长准种异质性的研究还未见报道。本研究应用CBS及NGS方法扩增并获得急性乙型肝炎(AHB)、慢性HBV携带(IT)、慢性乙型肝炎(CHB)、慢加急性乙型肝炎伴肝衰竭(ACLF)、代偿期肝硬化(LC)患者血清病毒全长序列,结合生物信息学分析方法描述准种遗传异质性特征及探讨其临床意义,以期更好的阐述HBV自然史及致病机制。研究对象与方法本研究共纳入97名HBV感染的患者(AHB、IT、CHB、ACLF、LC)。40例应用CBS方法、87例应用NGS方法(30例同时应用两种方法)获得HBV全长基因组的准种后,通过生物信息学方法对准种的异质性(复杂度和离散度)特征进行分析,并建立了NGS大数据初筛流程和质控方法,最后分析五种不同感染阶段的病毒准种异质性、氨基酸突变指数、单个核苷酸复杂度、CP/Pre C核苷酸突变率的特点及其与临床病程演变的相关性。结果第一部分:40例HBV感染患者,采用CBS方法,平均每名患者获得14-17株HBV全长克隆,急性HBV感染的准种复杂度较慢性HBV感染的准种复杂度低;慢性HBV感染免疫耐受期准种复杂度低于免疫清除期;不同的免疫压力下Core区aa60-130及X区aa131-135氨基酸变异指数(MFI)有统计学差异,ACLF在这些区域氨基酸突变指数大于IT及AHB,CHB次之。高突变位点集中在Core区T、B细胞表位。第二部分:87例HBV感染患者,采用Illumina Miseq高通量测序获得30G数据,经过数据初筛获得可分析数据20G,约12 000 000条序列进入最终分析阶段。在建立高通量测序的大数据筛选流程的基础上,对于高通量数据进行筛选(步骤包括:测序质量、测序长度、序列比对优化、PCR错误纠正优化、内参质控评价)和生物信息学分析,每个区段丰度(除P3外)中位数为6 000(1 500-20000)。在五种不同感染阶段中,IT的复杂度(Sn)和平均遗传距离(d)最低,其次为CHB和AHB,ACLF与LC的Sn和d最高。准种的Sn和d在CHB患者中与高谷丙转氨酶(5×ULN)、与总胆红素(1×ULN)血症、与ACLF预后无关。BCP/Pre C区核苷酸的分析发现:ACLF和LC患者在CP区A1762T、G1764A、A1846T/C的变异率达到50%-90%,高于其他组(P0.001)。T1800C在感染B基因型的ACLF患者中变异率最高达46%,而在C基因型中仅有2.4%。未经核苷类似物治疗的患者病毒准种耐药位点突变率在LC组高于其他组(1-4%vs.1%)。CBS与NGS的Sn和d相关性和一致性较差(P0.05)。综合上述结果发现,AHB准种异质性在CBS研究中为最低,但是在NGS研究中高于IT及CHB准种异质性。慢性感染患者的HBV准种复杂度与免疫压力和感染时间有关,即免疫压力越大(ACLF),感染时间越长(LC),复杂度越高,B细胞表位对应的氨基酸突变率(HBc Ag)越高。IT患者三年的HBV准种变化的主要发生在HBs Ag/RT区域,表现为突变的积累。结论本研究建立了Illumina Miseq高通量测序研究HBV准种的大数据筛选流程和质控分析方法,发现在低丰度变异的检测和准种模拟方面,Illumina Miseq描述准种异质性的表现力较CBS方法更敏感、准确和高效。对HBV准种异质性的分析可以间接反映机体免疫系统对病毒的应答状态及感染时间的长短,从而为临床个体化抗病毒治疗提供科学依据。
【关键词】：肝炎病毒 乙型 准种 Illumina Miseq PCR-克隆-测序 遗传异质性 突变率指数
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 摘要5-7
• abstract7-9
• 缩写/符号说明9-12
• 绪论12-15
• 第一部分 采用PCR-克隆-测序（CBS）方法分析不同感染阶段HBV全长准种异质性及其临床意义15-51
• 引言16-21
• 研究对象与方法21-35
• 结果35-46
• 讨论46-50
• 结论50-51
• 第二部分 采用Illumina Miseq （NGS）方法分析不同感染阶段HBV准种异质性及其临床意义51-113
• 引言52-58
• 研究对象与方法58-76
• 结果76-106
• 讨论106-112
• 结论112-113
• 展望113-115
• 参考文献115-124
• 致谢124-127
• 附录127-147
• 攻读学位期间取得的主要成绩147-148

【参考文献】

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1 ;慢性乙型肝炎防治指南[J];中华传染病杂志;2005年06期

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本文编号：860089