HBsAg和抗HBs双阳性患者S基因新增N-糖基化突变的临床意义分析

发布时间：2017-09-18 12:14

  本文关键词：HBsAg和抗HBs双阳性患者S基因新增N-糖基化突变的临床意义分析

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【摘要】：目的:分析HBV(Hepatitis B virus,HBV)HBsAg+抗HBs双阳性患者S基因主要亲水区(major hydrophilic region,MHR)新增N-糖基化突变特点,揭示HBsAg+抗HBs双阳性的发生机制和临床意义。方法:对284例HBsAg+抗HBs双阳性和314例HBsAg单阳性乙型肝炎病毒感染者S基因扩增及测序分析。对1例携有MHR区双N-糖基化新型突变株的慢性乙肝患者血清样本进行随访收集和深入研究,对HBV前S/S基因进行扩增和克隆测序,观察新增双N-糖基化突变的演变过程。构建pcDNA3.1(-)-myc-His A和pTriEx-mod-1.1HBV野生株、2种临床变异株和定点回复突变株重组质粒,瞬时转染HepG2肝癌细胞,采用实时荧光定量PCR法检测细胞培养上清中HBV DNA和细胞内复制中间体水平,分析突变对病毒复制力和分泌能力的影响,并对细胞培养上清中HBs Ag进行绝对定量,同时采用Western blotting和免疫荧光技术对HBsAg-His融合蛋白进行检测,分析突变对病毒抗原性的影响。结果:284例HBsAg+抗HBs双阳性患者中MHR区新增N-糖基化突变的检出率为11.3%(32/284),显著高于314例HBsAg单阳性患者的2.9%(9/314)(P0.01)。284例HBsAg+抗HBs双阳性患者中72例为肝细胞癌(Hepatocellμlar carcinoma,HCC),在HBsAg+抗HBs双阳性伴新增N-糖基化突变者中检出率为46.9%(15/32),显著高于HBsAg+抗HBs双阳性未伴新增N-糖基化突变的22.6%(57/252)(P0.01)。从1例患者中检出的新型株突变形式为s116-118TST→NST+s131-133TSM→NST,并联合sP120缺失+G145D突变,在3份随访样本中该突变株分别占98.0%、2.0%和2.5%,在第2份样本中检出s130-132GTS→NSS单N-糖基化突变株,占17.6%,但无sP120缺失+G145D联合突变。与野生株相比,新型突变株复制力提高31%,但HBsAg定量降低。免疫荧光结果显示,双N-糖基化定点回复突变株可部分恢复HBsAg检出水平,提示除双N-糖基化突变外,s P120缺失+G145D联合突变对HBsAg抗原性减弱也有明显影响。结论:HBV S基因MHR区新增N-糖基化突变与HBsAg+抗HBs双阳性相关,两者同时出现可能是HCC发生的高风险因素;S基因MHR区新增双N-糖基化+sP120缺失+sG145D联合突变共同影响HBsAg抗原性。
【关键词】：乙型肝炎病毒 S基因 突变 复制力 抗原性
【学位授予单位】：桂林医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.62
【目录】：

• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-13
• 英汉缩略词对照表13-15
• 前言15-17
• 第一部分 临床样本筛查分析HBV S基因新增N-糖基化突变17-26
• 1.1 实验材料与仪器17-18
• 1.1.1 研究对象17
• 1.1.2 主要实验试剂17-18
• 1.1.3 主要仪器18
• 1.2 实验方法18-22
• 1.2.1 血清中HBV DNA的提取18-19
• 1.2.2 巢式PCR扩增HBV S区序列19-22
• 1.2.2.1 第一轮PCR扩增19-20
• 1.2.2.2 PCR产物电泳检测20
• 1.2.2.3 第2轮PCR扩增20-22
• 1.2.2.4 PCR产物的电泳检测22
• 1.2.3 测序及分析22
• 1.2.4 统计学方法22
• 1.3 结果22-23
• 1.3.1 巢式PCR扩增结果22-23
• 1.3.2 HBV S区基因新增N-糖基化突变临床数据分析结果23
• 1.4 结论23-24
• 1.5 讨论24-26
• 第二部分 HBsAg+抗HBs双阳性伴S区新增双N-糖基化突变临床意义分析的实验研究26-69
• 2.1 实验材料与仪器26-29
• 2.1.1 主要实验仪器26
• 2.1.2 主要试剂26-28
• 2.1.3 研究对象28-29
• 2.2 实验方法29-56
• 2.2.1 巢式PCR扩增HBV前S/S序列29-31
• 2.2.1.1 巢式第1轮PCR扩增29-30
• 2.2.1.2 第2轮PCR扩增30-31
• 2.2.1.3 PCR产物的检测31
• 2.2.2 HBV前S/S区序列的克隆及测序分析31-36
• 2.2.2.1 PCR产物纯化32
• 2.2.2.2 PCR产物末端加A32-33
• 2.2.2.3 与T载体连接33
• 2.2.2.4 转化33-34
• 2.2.2.5 挑菌及摇菌34
• 2.2.2.6 菌液PCR34-35
• 2.2.2.7 PCR产物电泳检测35
• 2.2.2.8 测序分析35-36
• 2.2.2.9 小提质粒36
• 2.2.3 定点突变36-38
• 2.2.3.1 PCR扩增37-38
• 2.2.3.2 PCR产物的消化38
• 2.2.3.3 转化38
• 2.2.3.4 其他38
• 2.2.4 pTriEx-mod-1.1 HBV重组载体构建38-45
• 2.2.4.1 双酶切39-40
• 2.2.4.2 胶回收40
• 2.2.4.3 连接40-41
• 2.2.4.4 转化41
• 2.2.4.5 p TriEx+pre S/S阳性重组子的筛选41-43
• 2.2.4.6 甘油保菌43
• 2.2.4.7 转染级质粒的提取及浓度测定43-45
• 2.2.5 pTriEx-mod-1.1 HBV重组质粒瞬时转染细胞及检测分析45-48
• 2.2.5.1 瞬时转染45-46
• 2.2.5.2 细胞上清中HBsAg及HBV DNA绝对定量检测46-47
• 2.2.5.3 细胞内中间复制体提取及绝对定量47-48
• 2.2.6 pcDNA3.1/myc-His(-) A+S基因重组载体构建48-52
• 2.2.6.1 PCR扩增HBV S区基因49-50
• 2.2.6.2 PCR产物纯化50
• 2.2.6.3 双酶切及胶回收纯化50-51
• 2.2.6.4 连接51
• 2.2.6.5 转化51
• 2.2.6.6 阳性重组子的筛选51
• 2.2.6.7 甘油保菌51
• 2.2.6.8 转染质粒的提取及浓度测定51-52
• 2.2.7 pc DNA3.1/myc-His(-) A+S基因重组质粒瞬时转染细胞及检测分析52-56
• 2.2.7.1 瞬时转染52
• 2.2.7.2 蛋白定量52-53
• 2.2.7.3 Western Blotting检测细胞内HBV S融合蛋白表达53-55
• 2.2.7.4 HBV S融合蛋白的去糖基化55-56
• 2.2.7.5 免疫荧光检测细胞内HBV S融合蛋白表达56
• 2.3 结果56-65
• 2.3.1 pEASY-T+preS/S克隆构建及序列分析结果56-58
• 2.3.2 定点突变结果58-59
• 2.3.3 p Tri Ex+pre S/S重组质粒构建及检测结果59-62
• 2.3.3.1 p TriEx+pre S/S重组质粒构建59-60
• 2.3.3.2 细胞内HBV复制中间体与培养上清HBV DNA定量检测60-61
• 2.3.3.3 细胞培养上清中HBsAg定量61-62
• 2.3.4 pcDNA3.1/myc-His(-) A+HBV S基因重组质粒构建与检测62-65
• 2.3.4.1 pcDNA3.1 真核表达重组质粒构建62-63
• 2.3.4.2 HBV S区融合蛋白的Western Blotting分析63-64
• 2.3.4.3 免疫荧光检测结果64-65
• 2.4 结论65-66
• 2.5 讨论66-69
• 第三部分 总结论69-70
• 参考文献70-76
• 附录（综述）76-89
• 参考文献84-89
• 攻读学位期间发表的学术论文目录89-90
• 致谢90-92

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本文编号：875476