抗肝纤维化新型异喹啉类化合物的筛选及机制研究

发布时间：2017-09-20 00:39

  本文关键词：抗肝纤维化新型异喹啉类化合物的筛选及机制研究

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【摘要】：背景与目的:活化的HSC凋亡障碍是肝纤维化难以逆转的主要原因。异喹啉生物碱具有明显细胞毒作用,可显著诱导肿瘤细胞凋亡。为了保留异喹啉生物碱促凋亡活性并降低其细胞毒性,与复旦大学化学系合作,我们构建了新型异喹啉类小分子化合物库。本课题的目的是从新型异喹啉类小分子库筛选出细胞毒性低促凋亡生物活性强的具有抗肝纤维化作用的新型异喹啉小分子化合物,由此希望研发出一类新型抗肝纤维化药物先导化合物。方法:小分子化合物的筛查:(1)将复旦大学化学系合成的小分子化合物分类整理。(2)MTT法检测不同小分子化合物不同浓度(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,80μg/ml)处理HSC-T6细胞24小时后,HSC增殖改变,并计算IC50值。(3)Hochest法检测上述筛选出的阳性化合物(IC50100μg/ml)对HSC-T6细胞凋亡能力的影响。12-4-Y促HSC凋亡机制的探索:(1)MTT法检测不同浓度12-4-Y处理HSC-T6不同时间(12h、24h、36h、48h)后HSC增殖变化,台盼蓝染色评估细胞活力;(2)Hoechst染色检测凋亡小体;(3)流式细胞术对细胞凋亡进行定性检测;(4)检测凋亡关键蛋白Caspase3及其活化形式的表达变化;(5)Real time PCR检测凋亡相关基因表达变化。结果:(1)MTT结果提示,所构建的类天然小分子化合物库中存在6种化合物(12-4-Y、12-1-Y、09-4-Y、15-1-Y、11-2-Y、09-3-Y)对HSC-T6细胞增殖有明显的抑制作用,并且呈浓度依赖性,这6种阳性化合物的IC50值都在100μg/ml以内。(2)Hochest染色结果显示,上述阳性化合物中有1种化合物处理HSC-T6后可见明显的凋亡小体。这种化合物的编号为12-4-Y(1-乙基-8-甲氧基-5苯基吡唑并[5,1-a]异喹啉)。(3)进一步以不同浓度的12-4-Y处理HSC-T6细胞株后,MTT显示12-4-Y在12-48h及5-80μg/ml范围内可呈时间及浓度依赖性抑制HSC-T6增殖,台盼蓝染色显示40μg/ml 12-4-Y处理HSC-T6细胞系12h后细胞蓝染(0.53±0.04)%,与对照组(0.98±0.02)%相比明显增多(P0.05);(4)20μg/ml 12-4-Y处理HSC-T6细胞系24h后,Hoechst染色结果提示HSC-T6细胞系内可见较多的凋亡小体,同时流式细胞仪凋亡定量检测分析提示凋亡率为(29.23±1.20)%,显著高于对照组(5.47±1.39)%(P0.001);(5)Western blot结果提示凋亡关键蛋白Caspase3的裂解产物表达较空白对照组显著增加。(6)Real time PCR结果提示10μg/ml、20μg/ml 12-4-Y与HSC-T6共孵育24h后,线粒体凋亡途径相关的促凋亡基因Bax、Caspase9的表达显著上调,抑制凋亡相关基因Bcl2表达明显下调(P0.05)。结论:从异喹啉类小分子化合物库中,我们筛选到6种新型异喹啉类小分子化合物对大鼠肝星状细胞HSC-T6的增殖具有抑制作用;发现1种新型异喹啉类小分子化合物(12-4-Y)能显著诱导HSC-T6凋亡,其机制可能与激活线粒体凋亡途径相关。
【关键词】：肝纤维化 肝星状细胞 异喹啉化合物 细胞凋亡
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 中英文缩略语11-13
• 绪论13-17
• 第一部分 抗肝纤维化新型异喹啉类化合物的筛选17-27
• 引言17-18
• 1. 材料与方法18-22
• 1.1 材料18-19
• 1.1.1 实验细胞18
• 1.1.2 实验所用化合物18
• 1.1.3 实验试剂18
• 1.1.4 实验材料18
• 1.1.5 实验仪器18-19
• 1.2 方法19-22
• 1.2.1 细胞培养19
• 1.2.2 细胞处理及分组19-20
• 1.2.3 MTT法检测细胞增殖20-21
• 1.2.4 Hoechst染色法检测细胞凋亡21-22
• 2. 结果22-25
• 2.1 不同化合物作用HSC后细胞活力改变22-24
• 2.2 不同化合物对细胞凋亡的作用24-25
• 3. 讨论25-27
• 第二部分 新型异喹啉化合物促肝星状细胞凋亡机制研究27-49
• 引言27-29
• 1 材料与方法29-39
• 1.1 材料29-32
• 1.1.1 实验化合物29
• 1.1.2 实验细胞29
• 1.1.3 实验试剂29-31
• 1.1.4 试剂配制31
• 1.1.5 实验耗材及仪器31-32
• 1.2 试验方法32-39
• 1.2.1 大鼠活化肝星状细胞的培养与MTT检测32-33
• 1.2.2 细胞周期检测33-34
• 1.2.3 凋亡定性（凋亡小体）检测34
• 1.2.4 凋亡定量（流式细胞术）检测34-35
• 1.2.5 Western blot检测caspase3及其活化形式的表达变化35-37
• 1.2.6 Realtime PCR检测凋亡相关基因表达变化37-39
• 1.2.7 统计学处理39
• 2 结果39-45
• 2.1 124Y对HSC细胞系增殖的影响39-42
• 2.1.1 MTT实验检测 124Y对HSC-T6细胞系增殖抑制效果39-40
• 2.1.2 细胞周期检测 124Y对HSC-T6是否有周期阻滞作用40-42
• 2.2 124Y促进HSC细胞系凋亡的效果42-43
• 2.2.1 HSC凋亡的定性检测：Hoechst检测凋亡小体42
• 2.2.2 HSC凋亡的定量检测：流式细胞仪检测42-43
• 2.3 124Y促进HSC凋亡机制的初探43-45
• 2.3.1 Western blot检测caspase3及其活化形式表达变化43-44
• 2.3.2 Real-time PCR检测凋亡相关基因表达的变化44-45
• 3 讨论45-49
• 结论49-50
• 参考文献50-61
• 致谢61-63
• 攻读学位期间发表的学术论文目录63

【参考文献】

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本文编号：884907