熊果酸对原代肝星状细胞活化过程中NOX-Hedgehog信号网络的影响

发布时间：2017-09-20 18:24

  本文关键词：熊果酸对原代肝星状细胞活化过程中NOX-Hedgehog信号网络的影响

  更多相关文章： 原代肝星状细胞 熊果酸 Hedgehog信号通路 NADPH氧化酶 Rac1 TGF-β

【摘要】：背景:肝纤维化是由多种病因所引起的慢性肝脏疾病的共同病理过程,其主要特征为细胞外基质(extracellular matrix,ECM)增生与降解失衡,导致肝脏内ECM过度沉积。活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是ECM产生的主要细胞来源,因此,原代肝星状细胞(Quiescent hepatic stellate cells,Q-HSCs)的激活、增殖并转化为成纤维细胞样肝星状细胞(myofibroblastic hepatic stellate cells,MF-HSCs)在肝纤维化发生发展过程中起着关键性作用。Hedgehog(Hh)信号通路在肝脏胚胎发育以及成熟肝脏的损伤修复过程发挥着重要的作用。越来越多研究表明,Hh信号通路的持续激活促进Q-HSC转化为MF-HSC,进而促进肝纤维化发展。NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)参与介导一系列促纤维化信号通路,有学者研究发现,NOX亚基Rac1参与了对Hh信号通路的调控,它能激活Hh通路,进而促使Q-HSC激活转化为MF-HSC。我们前期研究发现熊果酸能显著抑制瘦素诱导的HSC-T6中NOX亚基Rac1蛋白表达,进而抑制Hh信号通路活性。基于以上研究及前期研究成果,本研究将进一步以原代HSC为研究对象,观察Q-HSC转化过程中NOX对Hh信号通路的调控作用及熊果酸对该信号网络的的影响。目的:观察Q-HSC活化转化过程中NOX对Hh信号通路的调控作用,明确熊果酸对NOX-Hh信号网络的影响及机制。方法:取分离提取长至第5天的原代肝星状细胞,随机分成以下各组:正常对照组;熊果酸组(40μM);TGF-β组(5μg/L);熊果酸干预组(TGF-β+熊果酸);DPI干预组(TGF-β+DPI 10μM)。干预组分别给予熊果酸和DPI(NOX特异性抑制剂)预处理半小时之后再加入TGF-β,各组经相应药物作用12h后,提取细胞总RNA,用q RT-PCR法检测药物处理后HSC对I型胶原和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)m RNA表达以及Hh信号通路中Shh、Smo、Gli2和NOX亚基Rac1的m RNA表达;药物作用24小时后,提取每组HSC总蛋白,采用Western blotting分别检测Rac1、Shh、Smo、Gli2及α-SMA蛋白表达。结果:1.熊果酸对Q-HSC活化过程中I型胶原m RNA、α-SMA m RNA表达的影响TGF-β刺激原代HSC12h后,I型胶原和α-SMA m RNA的表达比空白对照组明显增加(P0.01);熊果酸自身对照组I型胶原和α-SMA m RNA表达明显低于空白对照组(P0.05;P0.01);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸进行干预后其I型胶原和α-SMA m RNA水平较TGF-β刺激组显著降低(P0.01),并且与NOX的抑制剂DPI相比I型胶原和α-SMA m RNA的表达无统计学差异(P0.05)。以上结果说明,原代HSC在活化过程中I型胶原和α-SMA m RNA表达明显升高,而熊果酸干预能抑制原代HSC活化过程中I型胶原和α-SMA m RNA表达。2.熊果酸对Q-HSC活化过程中Rac1 m RNA表达的影响TGF-β刺激原代HSC 12h后,Rac1 m RNA的表达比空白对照组明显增加(P0.01);熊果酸自身对照组Rac1 m RNA表达明显低于空白对照组(P0.05);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸进行干预后其Rac1 m RNA水平较TGF-β刺激组显著降低(P0.05),并且与NOX的抑制剂DPI相比Rac1 m RNA的表达无统计学差异(P0.05)。以上结果说明,原代HSC在活化过程中NOX亚基Rac1表达上调,熊果酸可抑制原代HSC活化过程中NOX亚基Rac1 m RNA的表达。3.熊果酸对Q-HSC活化过程中Shh、Smo、Gli2 m RNA表达的影响TGF-β刺激原代HSC 12h后,Shh、Smo、Gli2 m RNA的表达比空白对照组明显增加(P0.01;P0.01;P0.05);熊果酸自身对照组Shh、Smo、Gli2 m RNA表达明显低于空白对照组(P0.01;P0.01;P0.05);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸进行干预后其Shh、Smo、Gli2 m RNA水平较TGF-β刺激组显著降低(P0.01),并且与NOX的抑制剂DPI相比Shh、Smo、Gli2 m RNA的表达无统计学差异(P0.05)。以上结果说明,原代HSC在活化过程中Hh信号通路的Shh、Smo、Gli2基因表达上调,NOX参与了Shh、Smo、Gli2基因表达的调控,熊果酸可抑制原代HSC活化过程中Shh、Smo、Gli2 m RNA的表达。TGF-β刺激原代HSC 24h后,α-SMA蛋白表达比空白对照组明显增加(P0.01);熊果酸自身对照组α-SMA蛋白表达明显低于空白对照组(P0.05);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸进行干预后其α-SMA蛋白水平较TGF-β刺激组显著降低(P0.01),并且与NOX的抑制剂DPI相比α-SMA蛋白表达无统计学差异(P0.05)。由于α-SMA蛋白是HSC活化的标志,以上结果说明NOX介导了TGF-β诱导的原代HSC活化,熊果酸可抑制原代HSC活化。5.熊果酸对Q-HSC活化过程中Rac1蛋白表达的影响TGF-β刺激原代HSC 24h后,Rac1蛋白表达比空白对照组明显增加(P0.05);熊果酸自身对照组Rac1蛋白表达明显低于空白对照组(P0.01);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸进行干预后其Rac1蛋白水平较TGF-β刺激组显著降低(P0.01),并且与NOX的抑制剂DPI相比Rac1蛋白的表达无统计学差异(P0.05)。以上结果说明,原代HSC活化过程中NOX亚基Rac1表达上调,熊果酸可抑制原代HSC活化过程中NOX亚基Rac1蛋白的表达。6.熊果酸对Q-HSC活化过程中Shh、Smo、Gli2蛋白表达的影响TGF-β刺激原代HSC 24h后,Shh、Smo、Gli2蛋白的表达比空白对照组明显增加(P0.05;P0.05;P0.01);熊果酸自身对照组Shh、Smo、Gli2蛋白表达明显低于空白对照组(P0.01);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸进行干预后其Shh、Smo、Gli2蛋白表达水平较TGF-β刺激组显著降低(P0.01),并且与NOX的抑制剂DPI相比Shh、Smo、Gli2蛋白的表达无统计学差异(P0.05)。以上结果说明,原代HSC在活化过程中Hh信号通路的Shh、Smo、Gli2蛋白表达上调,NOX参与了Shh、Smo、Gli2蛋白表达的调控,熊果酸可抑制原代HSC活化过程中Shh、Smo、Gli2蛋白的表达。4.熊果酸对Q-HSC活化过程中α-SMA蛋白表达的影响结论:1、TGF-β诱导Q-HSC激活转化为MF-HSC过程中NOX参与调控Hh信号通路Shh、Smo、Gli2的基因和蛋白表达。2、熊果酸能抑制Q-HSC激活转化过程中Hh信号通路Shh、Smo、Gli2表达,并抑制I型胶原及α-SMA表达,其机制可能通过抑制NOX的活性与亚基表达有关。
【关键词】：原代肝星状细胞 熊果酸 Hedgehog信号通路 NADPH氧化酶 Rac1 TGF-β
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 摘要3-7
• Abstract7-14
• 第1章 引言14-17
• 第2章 材料与方法17-27
• 2.1 材料17-19
• 2.1.1 实验动物17
• 2.1.2 主要试剂17-18
• 2.1.3 主要仪器18-19
• 2.2 研究方法19-26
• 2.2.1 主要液体的配制19-21
• 2.2.2 原代HSC分离提取、培养与鉴定21-22
• 2.2.3 实验分组及药物处理22-23
• 2.2.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测I型胶原、α-SMA、NOX亚基Rac1以及Hh信号通路mRNA的表达23-25
• 2.2.5 Western-blotting检测原代HSC细胞蛋白的表达25-26
• 2.3 统计学处理26-27
• 第3章 结果27-39
• 3.1 原代HSC纯度、活性、静息态及活化状态鉴定27
• 3.2 熊果酸对Q-HSC活化过程中I型胶原m RNA表达的影响27-28
• 3.3 熊果酸对Q-HSC活化过程中 α-SMA表达的影响28-30
• 3.3.1 熊果酸对Q-HSC活化过程中 α-SMA mRNA表达的影响28-29
• 3.3.2 熊果酸对Q-HSC活化过程中 α-SMA蛋白表达的影响29-30
• 3.4 熊果酸对Q-HSC活化过程中NOX亚基Rac1表达的影响30-32
• 3.4.1 熊果酸对Q-HSC活化过程中Rac1 mRNA表达的影响30-31
• 3.4.2 熊果酸对Q-HSC活化过程中Rac1蛋白表达的影响31-32
• 3.5 熊果酸对Q-HSC活化过程中Hedgehog信号通路的影响32-39
• 3.5.1 熊果酸对Q-HSC活化过程中Shh mRNA表达的影响32-33
• 3.5.2 熊果酸对Q-HSC活化过程中Smo mRNA表达的影响33-34
• 3.5.3 熊果酸对Q-HSC活化过程中Gli2 mRNA表达的影响34-35
• 3.5.4 熊果酸对Q-HSC活化过程中Shh蛋白表达的影响35-36
• 3.5.5 熊果酸对Q-HSC活化过程中Smo蛋白表达的影响36-37
• 3.5.6 熊果酸对Q-HSC活化过程中Gli2蛋白表达的影响37-39
• 第4章 讨论39-44
• 4.1 NOX对Hh信号通路的调控39
• 4.2 TGF-β 及NOX-Hh信号通路在HSC激活转化中的作用及机制39-40
• 4.3 熊果酸的抗肝纤维化作用及机制40-41
• 4.4 熊果酸对原代HSC活化过程中Hh信号通路的影响41-42
• 4.5 熊果酸对原代HSC中NOX-Hh信号网络的影响42-44
• 第5章 结论与展望44-45
• 5.1 结论44
• 5.2 展望44-45
• 致谢45-46
• 参考文献46-50
• 附图50-53
• 攻读学位期间的研究成果53-54
• 综述54-59
• 参考文献57-59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 陈涛;何文华;朱萱;黄雯;余珊珊;陈标;黄德强;;熊果酸对血管紧张素Ⅱ诱导肝星状细胞内NADPH氧化酶的活化及下游信号通路的影响[J];上海交通大学学报(医学版);2015年01期

2 施凤;何文华;朱萱;李弼民;张琨和;黄雯;;熊果酸(UA)对大鼠活化型肝星状细胞(HSC)的NADPH氧化酶(NOX)亚基及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路活化的影响[J];复旦学报(医学版);2014年03期

3 陈璐;何文华;朱萱;李弼民;张q和;施凤;张新华;;熊果酸对肝星状细胞NADPH氧化酶-Hedgehog信号通路的影响[J];第三军医大学学报;2014年05期

4 张新华;何文华;朱萱;李弼民;张q和;陈璐;施凤;;熊果酸对活化型肝星状细胞NADPH氧化酶亚基p47~(Phox)表达及ERK1/2信号通路活化的影响[J];第二军医大学学报;2012年06期

5 李博;李弼民;何文华;刘志坚;张q和;陈江;刘戈云;张新华;朱萱;;熊果酸对肝星状细胞内活性氧产生的影响及与细胞凋亡的关系[J];广东医学;2011年11期

6 张新华;朱萱;;NOX通过ROS介导的信号通路与肝纤维化[J];国际消化病杂志;2011年01期

7 何文华;朱萱;;NADPH氧化酶产生的活性氧簇对肝星状细胞内信号转导的调控[J];世界华人消化杂志;2008年17期

8 戴颖;朱萱;;熊果酸抗实验性大鼠肝纤维化作用机制的研究[J];江西医药;2008年05期

，

本文编号：889679