BCL6B基因在抑制肝细胞肝癌和肝纤维化的发生发展的机制研究

发布时间：2017-09-22 14:34

  本文关键词：BCL6B基因在抑制肝细胞肝癌和肝纤维化的发生发展的机制研究

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【摘要】：肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,目前占我国恶性肿瘤死亡原因的第二位。肝脏炎症和肝纤维化是造成肝癌的重要因素,同时也对患者的生活质量造成了严重影响。肝癌,尤其是伴有肝纤维化的肝细胞肝癌,除了彻底的手术切除,目前尚缺乏其他有效的治疗方法。通过基因技术手段进行肿瘤分子标志物的筛选和基因治疗,是目前治疗肝癌的研究方向和研究热点。B细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤6成员B (B cell CLL/lymphoma 6 member B BCL6B)基因是一个新颖的抑癌基因,最近被发现在胃癌中低表达,然而在别的肿瘤的表达尚不清楚。研究表明,肿瘤中BCL6B基因表达量的降低与启动子的高甲基化相关,而且伴有患者术后生存时间的减少,提示BCL6B可能与肿瘤的发展密切相关。第一部分BCL6B基因在抑制肝细胞肝癌的发生发展及其机制研究目的：探索BCL6B在肝细胞肝癌中的表达量改变,并验证其在体内外实验中的抑癌作用及机制。方法：运用定量PCR、免疫印迹(WB)和免疫组织化学(IHC)的方法分析肝细胞肝癌与癌旁正常肝组织中BCL6B的表达水平。本研究采用肝癌细胞株HepG2与SMMC-7721细胞株,运用慢病毒载体外源性加入重组的BCL6B,建立过表达BCL6B的细胞模型。应用CCK-8和克隆形成试验检测BCL6B对细胞增殖的影响,流式细胞术分析细胞的凋亡和周期阻滞情况,Transwell试验检测细胞迁移和侵袭能力改变。通过裸鼠成瘤试验在体内环境验证BCL6B的抑癌作用。通过表达谱芯片探讨BCL6B抑制肝癌发生的可能机制。结果：相比正常肝细胞,7种肝癌细胞株中BCL6B的表达量出现了不同程度的降低。选择肝癌细胞株HepG2与SMMC-7721过表达BCL6B,发现细胞增殖能力与细胞活性下降、细胞凋亡增多、细胞迁移和侵袭能力下降,细胞周期阻滞于G0/G1期。体内试验发现BCL6B使裸鼠皮下成瘤能力明显减弱。表达谱芯片显示BCL6B可能通过多种信号通路途径影响肝癌的发生发展。定量PCR结果显示,与癌旁正常肝组织相比,肝癌组织中BCL6B的mRNA的水平显著降低(p0.01),在蛋白水平通过WB和IHC方法同样得到了验证。联系临床病理资料分析,发现BCL6B的表达量与肝硬化情况呈正相关(p0.05),与门静脉癌栓(PVTT)呈负相关(p0.05)。生存曲线表明低表达BCL6B的肝癌患者预后较差(p0.05),多因素回归分析显示BCL6B是肝癌预后的独立预测因子。结论：BCL6B在肝癌组织中低表达,与肝硬化、PVTT及患者生存率密切相关。发现BCL6B可能通过多途径影响肿瘤细胞的增殖、凋亡和转移能力。第二部分BCL6B抑制肝纤维化发生发展及其机制研究目的：验证BCL6B在肝纤维化组织中表达量的改变,探索BCL6B抑制肝损纤维化的机制。方法：用二乙基亚硝胺(DEN)或四氯化碳(CCl4)处理大鼠,分别造成急性肝脏损伤和慢性肝脏损伤模型。用过表达BCL6B的慢病毒或干扰BCL6B的腺病毒,分别通过门静脉或尾静脉注射,使大鼠肝脏过表达或低表达BCL6B。通过检测炎症因子和纤维化指标分子的表达情况来验证BCL6B对肝脏损伤的保护作用。结果：肝纤维化的大鼠肝脏组织和慢性肝病患者肝脏组织中BCL6B的表达量,相比于正常肝脏组织均显著增加。肝脏过表达外源性BCL6B能显著的降低肝脏的炎症因子和肝纤维化因子,能有效的抵抗肝脏纤维化的发生。另一方面,敲低肝脏BCL6B的表达量则加重了肝脏纤维化的发生。此外,我们发现BCL6B的抗纤维化作用可能是通过肝脏生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)途径起作用的。结论：BCL6B在肝纤维组织中高表达。BCL6B有抗炎抗肝纤维化作用,而这种保护作用可能是通过HGF途径起作用的。
【关键词】：BCL6B 肝癌 预后 凋亡 BCL6B 肝纤维化 肝脏损伤 肝硬化
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7;R575.2
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-10
• Abstract10-14
• 缩略词表14-19
• 绪论19-24
• 参考文献21-24
• 第一部分 BCL6B基因抑制肝细胞肝癌的发生发展及其机制研究24-63
• 1 前言24-25
• 2 材料与方法25-41
• 2.1 实验材料25-27
• 2.2 实验方法27-40
• 2.3 统计分析40-41
• 3 实验结果41-58
• 3.1 肝癌细胞株中BCL6B的表达水平41-42
• 3.2 检测感染BCL6B慢病毒的过表达效率42
• 3.3 BCL6B对细胞增殖的影响42-45
• 3.4 BCL6B对细胞凋亡及周期的影响45-46
• 3.5 BCL6B对细胞迁移和侵袭能力的影响46-47
• 3.6 BCL6B对裸鼠成瘤能力的影响47-48
• 3.7 BCL6B抑制肝癌细胞的多种信号途径48-51
• 3.8 BCL6B在肝癌患者组织中的差异表达51-53
• 3.9 BCL6B表达量与临床病理特征及患者预后的相关性53-58
• 4 讨论58-60
• 5 结论60-61
• 6 参考文献61-63
• 第二部分 BCL6B抑制肝纤维化发生发展及其机制研究究63-93
• 1 前言63-65
• 2 材料和方法65-73
• 2.1 实验材料65-67
• 2.2 实验方法67-72
• 2.3 统计分析72-73
• 3 实验结果73-87
• 3.1 急慢性肝损伤对BCL6B的影响73
• 3.2 BCL6B减轻损伤肝脏的炎症反应73-77
• 3.3 BCL6B改善受损肝脏的纤维化情况77-80
• 3.4 BCL6B通过调节HGF而抑制HSCs的活化80-85
• 3.5 干扰BCL6B表达量会加重肝脏纤维化程度85-87
• 4 讨论87-89
• 5 结论89-90
• 6 参考文献90-93
• 综述93-118
• 参考文献105-118
• 作者简历及在学期间所取得的科研成果118

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