COFs对肝细胞线粒体损伤及能量代谢障碍机制的研究

发布时间：2017-09-25 11:47

  本文关键词：COFs对肝细胞线粒体损伤及能量代谢障碍机制的研究

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【摘要】：研究背景及目的烹调油烟(Cook oil fumes,COFs)是我国室内生活环境中最常见的空气污染物之一,其成分复杂,严重威胁着居民(特别是女性)的健康。COFs中含有的大量脂溶性化合物,经呼吸道进入机体后,肝脏是其主要的代谢器官,在此过程中可能会产生肝毒性物质导致肝细胞损伤。氧化损伤是COFs最主要的毒作用,体内体外研究均已证实COFs可导致细胞内SOD活性降低、MDA的含量增加、ROS的堆积甚至抑制细胞ATP酶的活性。肝脏作为机体最重要的解毒器官,虽然已有动物实验已经证实,COFs可导致肝脏发生炎症、充血、水肿,微量元素代谢紊乱等病理性改变,但COFs致肝毒性的作用机制并不清楚,而线粒体作为细胞发生氧化损伤的靶,COFs能否诱导其功能损伤更是鲜见报道。本研究除了阐明COFs诱导肝细胞线粒体功能损伤外,还对其诱导肝细胞能量代谢障碍机制进行了探讨。线粒体是细胞能量合成的主要场所,能量代谢障碍是线粒体功能损伤后的另一种细胞毒性结局,与氧化损伤后ROS的大量堆积相关,因此从分子水平上探索COFs诱导肝细胞氧化损伤及能量代谢障碍,有利于深入了解COFs对肝细胞的毒作用机制,从而为相关的生物学监测、病因探索与预防提供科学依据。研究方法1.COFs对肝细胞的毒作用及线粒体功能的损伤首先用不同浓度COFs分别处理体外培养的HL7702人正常肝细胞24h,MTT法检测不同浓度COFs对肝细胞存活率的影响,SPSS曲线拟合求出COFs对细胞的半数致死浓度,并确定染毒剂量。COFs染毒细胞24h后,激光共聚焦显微镜检测细胞内ROS的水平,高效液相色谱法检测细胞内腺苷酸(ATP\ADP\AMP)含量;肝细胞线粒体酶活性、线粒体膜通透性转运孔(MPTP)的开放度、线粒体跨膜电位(ψm)及线粒体呼吸链复合体(I~V)活性分别采用酶标仪、荧光分光光度计、激光共聚焦显微镜及紫外分光光度计法测定。2.COFs对肝细胞能量代谢障碍机制的影响COFs处理肝细胞24h后,荧光定量PCR法检测线粒体DNA编码的能量代谢相关基因COX I-III、ATPase6和ATPase8的表达水平,以及核DNA编码的能量代谢相关基因miR18lc的表达水平,并采用Spearman相关分析各指标间的相关性。研究结果1.cofs对肝细胞的毒作用及线粒体功能的损伤1.1cofs对肝细胞的毒作用①cofs染毒肝细胞24h后,可引起肝细胞存活率显著降低(f=365.568,p0.05),cofs染毒浓度与细胞生存率之间关系符合对数模型(r=0.929),对hl7702细胞的半数抑制浓度为318.10μg/ml,95%可信区间为277.31~366.87μg/ml。确定染毒剂量组为20,40,80,160μg/ml及dmso溶剂对照组。②cofs染毒肝细胞24h后,40~160μg/mlcofs组肝细胞内ros含量增高,与对照组相比差异有统计学意义(f=241.95,p0.01),cofs染毒浓度与ros水平之间存在正的线性相关关性(r=0.978,p0.01)。③与对照组相比,cofs处理组肝细胞内atp、adp、amp及tan的含量均呈明显下降趋势(f=60.16,p0.01;f=281.05,p0.01;f=86.90,p0.01;f=130.37,p0.01);在dmso~40μg/ml范围内,三组的atp/adp比值随着染毒剂量的升高而升高(f=234.21,p0.01);除80μg/ml组ec值较高外,其余各剂量组间ec值无明显变化。1.2cofs对肝细胞线粒体功能的损伤作用①cofs处理肝细胞24h后,对线粒体酶活性存在显著抑制性(f=587.185,p0.05),与对照组相比,则有20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml和160μg/mlcofs组对线粒体酶活性的相对抑制率分别为47.26%、90.30%、91.40%、95.83%。②随着cofs浓度的升高,mptp孔相对开放度越高(f=195.3,p0.05),以dmso组为参照,则有20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml和160μg/mlcofs组mptp孔相对开放度(%)分别为23.43%、33.22%、45.44%、56.64%。③在40~160μg/mlcofs浓度范围内,可促使ψm下降(f=43.796,p0.05)。④20~160μg/mlcofs对线粒体呼吸链复合体Ⅰ-Ⅴ的活性有不同程度的抑制作用(f=91.673,p0.01;f=434.581,p0.01;f=11.904,p=0.01;f=111.063,p0.01;f=79.111,p0.01)。2.cofs对肝细胞能量代谢障碍机制的影响①cofs染毒24h后,可使呼吸链复合体Ⅴ亚基atpase6及atpase8mrna总体呈上升趋势(f=130.297,p0.05;f=14.451,p0.05);呼吸链复合体Ⅳ亚基coxⅠ~Ⅲmrna总体呈上升趋势,(f=161.518,p0.05;f=8.282,p0.05;f=46.648,p0.05);ndna编码的mirna181mrna表达总体呈上升趋势(f=6.31,p0.05)。研究结论1.COFs可抑制HL7702肝细胞的活性,其半数抑制浓度为318.10μg/ml,95%可信区间为277.31~366.87μg/ml;COFs可使肝细胞内ROS堆积、腺苷酸合成受阻。2.COFs诱导线粒体酶活性降低、MPTP孔开放、ψm崩解及MRCCⅠ~Ⅴ活性降低等功能性损伤,COFs所致线粒体功能损伤与ROS堆积及腺苷酸合成受阻相关。3.COFs可通过上调ATPase6和ATPase8 mRNA的表达抑制MRCCⅤ活性干扰ATP合成,导致细胞能量代谢障碍,即COFs可通过ATPase6/ATPase8-MRCCⅤ-ATP通路诱导能量代谢障碍;及上调线粒体DNA编码的呼吸链复合体Ⅳ~Ⅴ亚基基因表达;COFs可使核DNA编码的miRNA181过表达,调控MRCCⅣ活性及其线粒体DNA COXⅠ~Ⅲ基因的表达上调,来影响细胞内ATP水平,即COFs可通过miRNA181-COXⅠ~Ⅲ-MRCCⅣ-ATP通路影响ATP合成,导致能量代谢障碍。4.mtDNA基因表达水平改变,可使MRCCI~V活性下降,诱导ROS升高的因素,而高浓度的ROS又可以反过来攻击mtDNA的表达,引起细胞氧化损伤及能量代谢障碍,即能量代谢相关基因表达水平改变,导致线粒体呼吸链复合体活性下降,可能是COFs诱导肝细胞线粒体能量代谢障碍和氧化损伤的原因之一。
【关键词】：烹调油烟 肝细胞 线粒体 能量代谢 基因表达
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 英汉缩略词表(按字母顺序排列)4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 技术路线图16-17
• 第一部分 烹调油烟对肝细胞及线粒体功能的影响17-48
• 1 材料17-20
• 2 实验方法20-29
• 3 实验结果29-42
• 4 讨论42-48
• 第二部分 COFs诱导的能量代谢障碍相关机制的研究48-66
• 1 材料49-50
• 2 实验方法50-55
• 3 实验结果55-63
• 4 讨论63-66
• 结论66-67
• 参考文献67-72
• 综述72-81
• 参考文献78-81
• 致谢81-82
• 攻读学位期间的成绩82

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 谢弋,庄志雄;Gr~(3+)、Gr~(6+)对鼠肺细胞线粒体膜电位改变及活性氧生成的研究[J];动物医学进展;2002年04期

2 王艳,刘雅诚,唐晖;线粒体DNA研究进展[J];法律与医学杂志;2002年02期

3 龙理良,陈锋,贺性鹏,袁秀琴;烹调油烟对大鼠的急性毒性研究[J];南华大学学报(医学版);2003年03期

4 沈孝兵,浦跃朴,王志浩,赵力;烹调油烟对暴露人群的免疫损伤作用[J];环境与职业医学;2005年01期

5 顾卫东;陈群;曾因明;;低温对脑缺血/再灌注期间沙土鼠海马CA1区延迟性神经元死亡及ATP水平和细胞色素氧化酶活性的影响[J];徐州医学院学报;2009年01期

6 张朝晖,陈锋,谭佑铭,让蔚清,张丹,罗招阳;烹调油烟致Balb/C小鼠肺癌的病理变化[J];中国公共卫生;2003年12期

7 张荣芳,陈锋,朱茂祥,杨陡华;烹调油烟冷凝物对细胞的氧化损伤研究[J];中国公共卫生;2004年03期

8 高玉堂,郑苇,张溶,高汝聂,徐昌文,廖美琳,杨子培,林震琼,汪锺贤,赵基津,张彦树,W.J.Blot,J.F.FraumeniJr.;上海市区672例女性肺癌病例对照研究[J];肿瘤;1987年05期

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本文编号：917132