胆汁酸对梗阻性黄疸肠黏膜屏障的保护作用及其机制的研究

发布时间：2017-09-27 19:00

  本文关键词：胆汁酸对梗阻性黄疸肠黏膜屏障的保护作用及其机制的研究

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【摘要】：梗阻性黄疸(obstructive jaundice,OJ)导致排入肠腔内的胆汁减少甚至缺如,引起肠腔内细菌过度生长,内毒素释放增多,肠上皮细胞增殖减少,凋亡增多,肠黏膜紧密连接破坏,从而造成肠黏膜屏障损伤通透性增高。肠腔内细菌及内毒素通过损伤的肠黏膜进入血液循环,引起局部及全身感染,甚至造成败血症、全身炎症反应综合征或多器官功能衰竭等严重并发症。胆汁酸是胆汁的活性成分,人类胆汁酸主要包括初级胆汁酸(胆酸和鹅去氧胆酸)、次级胆汁酸(石胆酸和去氧胆酸)以及它们的甘氨酸和牛磺酸结合形式。初级胆汁酸在肠道细菌作用下转化为次级胆汁酸。胆汁酸是一种两性分子,其主要功能是促进脂质和脂溶性维生素的消化和吸收。此外,胆汁酸还能够调节肠道菌群,维持肠黏膜屏障的完整性。最近研究发现胆汁酸还可作为信号分子调节自身生物合成,调节葡萄糖、脂质、药物和能量等代谢过程,并参与免疫反应、细胞增殖、凋亡和分化。胆汁酸膜受体TGR5是G蛋白偶联受体(GPCR),表达于多种器官和细胞,其中胆囊上皮和肠道表达最高。TGR5能够调节代谢和胆汁酸平衡。激活TGR5可以增加能量消耗,明显降低高脂饮食喂养小鼠的体重。TGR5可诱导肠内分泌细胞分泌胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1),增加胰岛素的敏感性,调节葡萄糖平衡。与野生型小鼠相比,TGR5敲除小鼠不仅总胆汁酸池容量降低,而且可抵抗胆固醇胆囊结石形成。TGR5还可以调节免疫反应,发挥抗炎作用。最近研究表明,TGR5还具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用,例如给予牛磺胆酸盐后可活化TGR5促进胆管上皮细胞的增殖。本课题重点研究胆汁对梗阻性黄疸时肠黏膜屏障的作用及TGR5的表达变化,并用动物及细胞模型验证鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)是否通过上调TGR5的表达促进肠上皮细胞增殖,从而保护肠黏膜屏障。影响第一部分:胆汁对梗阻性黄疸患者肠黏膜屏障的作用及对TGR5表达的目的:观察胆汁对梗阻性黄疸患者肠黏膜及TGR5表达的影响。方法:收集行内镜逆行胰胆管造影(ERCP)治疗的恶性胆道梗阻伴黄疸患者16例;其中接受胆管支架置入术(ERBD)进行胆汁内引流(internal biliary drainage,ID)的患者8例,接受鼻胆管引流术(ENBD)进行胆汁外引流(external biliary drainage,ED)的患者8例。所有患者在治疗前和治疗一周后取十二指肠乳头以下2-5 cm范围内肠黏膜组织,观察其形态学及超微结构的改变,应用免疫组织化学(IHC)和Western blot方法检测肠黏膜TGR5及增殖标志物增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)的分布及表达变化。同时收集患者治疗前后的血清,检测血清中肠上皮细胞标志酶二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)、肠型脂肪酸结合蛋白(intestinal fatty acid binding protein,I-FABP)以及肠内细菌产物内毒素(Lipopolysaccharides,LPS)和D-乳酸(D-lactate)的水平。结果:①光镜下观察HE染色结果,ID组患者与治疗前相比,肠黏膜绒毛较完整,上皮细胞排列相对整齐,肠黏膜损伤病理学评分为0.7±0.63,显著低于治疗前(2.5±0.37,P0.01)。ED组患者治疗前后肠黏膜形态学无明显变化,损伤病理学评分无统计学差异(P0.05)。②电镜下观察肠黏膜的超微结构,ID组患者与治疗前相比,微绒毛排列整齐,数量增多,紧密连接间隙变窄;ED组患者治疗前后,肠黏膜的超微结构无明显变化。③血清检测结果显示,ID组患者治疗后DAO、I-FABP、LPS和D-lactate含量分别为57.23±8.6 U/L,149.6±29.16 pg/ml,0.2±0.02EU/ml,1.0±0.2 m M,均较治疗前显著下降(96.12±12.51 U/L,302.5±6103 pg/ml,0.39±0.04 EU/ml,1.68±0.18 m M,P0.05)。而ED组患者治疗前后血清DAO、I-FABP、LPS、和D-lactate含量无显著差异(P0.05)。④IHC显示PCNA主要在肠上皮细胞的细胞核表达,TGR5主要表达于肠上皮细胞的细胞膜。ID组患者治疗后,PCNA和TGR5的表达高于治疗前,而ED组患者治疗前后,PCNA和TGR5的表达无明显差异。Western blot分析结果与免疫组化一致,ID组患者治疗后PCNA和TGR5的表达均较治疗前增多(P0.05,P0.01),而ED组患者治疗前后PCNA和TGR5的表达无显著差别(P0.05)。结论:胆汁能够促进梗阻性黄疸患者肠黏膜上皮细胞增殖,改善肠黏膜形态学及超微结构,降低其通透性,并增加TGR5的表达。TGR5可能与肠上皮细胞增殖有关。第二部分:胆汁酸对梗阻性黄疸大鼠肠黏膜屏障的作用及对TGR5表达的影响目的:建立梗阻性黄疸大鼠动物模型,探讨胆汁酸CDCA对肠黏膜屏障的作用及对肠黏膜TGR5表达的影响。方法:将30只Wistar大鼠随机分为3组,假手术组(sham operation,SHAM),胆总管结扎组+溶剂组(bile duct ligated+Vehicle,BDL+Vehicle),胆总管结扎+CDCA组(BDL+CDCA)。1周后取末端回肠黏膜组织观察其形态学及超微结构改变,应用IHC和Western blot方法检测肠黏膜TGR5、PCNA分布及表达的变化。同时,检测血清中DAO、I-FABP、LPS和D-lactate的水平。结果:①HE染色结果显示,SHAM组肠黏膜绒毛及上皮细胞排列整齐;BDL+Vehicle组肠黏膜的完整性被破坏,表现为小肠绒毛短粗,绒毛顶端上皮下间隙增大,上皮层与固有层分离;BDL+CDCA组肠黏膜绒毛较完整,上皮细胞排列相对整齐,肠黏膜损伤病理学评分为1.8±0.2,显著低于BDL+Vehicle组(2.6±0.16,P0.01)。②电镜下观察肠黏膜超微结构,SHAM组肠黏膜微绒毛排列整齐、紧密;BDL+Vehicle组肠黏膜微绒毛明显稀疏,紧密连接间隙增宽,胞浆有空泡形成;BDL+CDCA组肠黏膜微绒毛排列相对整齐,胞浆中未见空泡形成。③与SHAM组相比,BDL+Vehicle组血清DAO、I-FABP、LPS和D-lactate含量明显升高;而BDL+CDCA组与BDL+Vehicle组相比,血清DAO、I-FABP、LPS和D-lactate含量明显下降(P0.001)。④IHC显示,PCNA主要在细胞核表达,TGR5主要在细胞膜表达。BDL+Vehicle组肠黏膜PCNA和TGR5的表达均较SHAM组下降。而与BDL+Vehicle组相比,BDL+CDCA组肠黏膜PCNA和TGR5的表达明显升高。Western blot分析结果与免疫组化一致,BDL+Vehicle组肠黏膜PCNA和TGR5的表达均较SHAM组减少,而与BDL+Vehicle组相比,BDL+CDCA组肠黏膜PCNA和TGR5的表达明显升高(P0.01)。结论:胆汁酸CDCA能够促进梗阻性黄疸大鼠肠黏膜上皮细胞增殖,改善肠黏膜形态学及超微结构,降低其通透性,并上调TGR5的表达。TGR5可能与肠上皮细胞增殖有关。第三部分:胆汁酸通过上调TGR5表达促进肠上皮细胞增殖目的:探讨CDCA是否通过TGR5的表达促进肠上皮细胞增殖。方法:用LPS诱导人小肠上皮细胞株FHs 74 Int损伤,作为梗阻性黄疸肠黏膜损伤的细胞模型,观察胆汁酸CDCA刺激对LPS诱导的FHs 74Int损伤的影响。实验分四组:对照组(control)、CDCA组、LPS组和LPS+CDCA组。给予LPS(1 mg/ml)和/或CDCA(100μM)处理FHs 74Int细胞48 h,收集细胞。以慢病毒为载体在FHs 74 Int细胞中敲低和过表达TGR5,观察TGR5与肠上皮细胞增殖的关系。用RT-real time PCR及Western blot分析分别从m RNA水平及蛋白水平观察敲低及过表达效果。在TGR5敲低的FHs 74 Int细胞中,应用LPS(1 mg/ml)处理细胞48 h,实验分四组:对照组(Lv-sh Con)、TGR5敲低组(Lv-sh TGR5)、Lv-sh Con+LPS和Lv-sh TGR5+LPS。在TGR5过表达的FHs 74 Int细胞中,应用LPS(1 mg/ml)处理细胞48 h,试验分四组:对照组(Lv-Flag)、TGR5过表达组(Lv-TGR5)、Lv-Flag+LPS和Lv-TGR5+LPS。为进一步证明CDCA能够通过TGR5促进细胞增殖,给予LPS和/或CDCA刺激TGR5敲低的FHs 74 Int细胞48 h,试验分四组:Lv-sh Con、Lv-sh Con+LPS、Lv-sh Con+LPS+CDCA和Lv-sh TGR5+LPS+CDCA。收集上述分组细胞,用CCK-8检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期,Ed U检测细胞DNA合成情况,综合反映细胞增殖水平。应用Western blot分析检测PCNA及TGR5的表达。结果:①CCK-8分析结果表明,LPS刺激基础上加入CDCA处理后,FHs 74 Int细胞活力显著高于单纯LPS损伤组。流式细胞周期结果显示,LPS损伤基础上加入CDCA处理后,较LPS损伤组,S期细胞比例上升,而G0/G1期细胞比例下降。Ed U结果与CCK-8及细胞周期结果一致,LPS+CDCA组与LPS组相比,DNA合成增加。以上结果表明,CDCA处理可对抗LPS诱导的细胞增殖抑制。Western blot分析结果表明,LPS处理可抑制PCNA和TGR5表达,加入CDCA处理后,PCNA和TGR5表达较LPS损伤组显著升高,结果提示,胆汁酸可促进肠上皮细胞增殖及TGR5表达,二者具有一定正相关关系。②CCK-8分析结果表明,LPS刺激后,细胞活力减低,而用Lv-sh TGR5敲低内源性TGR5的表达后,细胞活力降低更为显著。细胞周期结果显示,LPS处理后,G0/G1期细胞比例上升,S期细胞比例下降,表明细胞被阻滞于G0/G1期,TGR5敲低组的G0/G1期阻滞更明显。Ed U结果显示,LPS处理后,细胞DNA合成受抑制,而TGR5敲低后,FHs 74 Int细胞的DNA合成进一步被抑制。Western blot分析表明,LPS可显著抑制增殖标志蛋白PCNA的表达,敲低TGR5可进一步下调PCNA水平。以上结果表明,敲低TGR5促进LPS对FHs 74Int细胞增殖的抑制,提示TGR5可促进细胞增殖。③CCK-8分析结果显示,在TGR5过表达及对照组细胞中,LPS刺激后,细胞活力均减低,而TGR5过表达组细胞活力较对照组有所升高。细胞周期结果显示,LPS处理后,G0/G1期细胞比例上升,而S期细胞比例下降,表明细胞被阻滞于G0/G1期,而TGR5过表达组的G0/G1期阻滞较对照组有所减轻。Ed U结果显示,LPS处理后,细胞DNA合成受抑制,而过表达TGR5可减弱LPS诱导的DNA合成抑制。Western blot分析表明,LPS可显著抑制增殖标志蛋白PCNA的表达,而过表达TGR5可抑制LPS引起的PCNA下调。结果表明,过表达TGR5可减弱LPS对FHs 74 Int细胞增殖的抑制,提示TGR5可促进细胞增殖。④LPS刺激后,细胞活力降低,G0/G1期细胞比例上升,S期细胞比例下降,DNA合成减少,PCNA下调,表明LPS可显著抑制细胞增殖。在LPS损伤的FHs 74 Int中加入CDCA后,细胞活力升高,G0/G1期细胞比例降低,S期细胞比例升高,DNA合成增加,PCNA上调,表明CDCA可减弱LPS对FHs 74 Int的增殖抑制。而在TGR5敲低的细胞中,CDCA刺激不能对抗LPS对FHs 74 Int的增殖抑制作用,表现为Lv-sh TGR5+LPS+CDCA组较Lv-sh Con+LPS+CDCA组,细胞活力降低,G0/G1期细胞比例上升,S期细胞比例下降,DNA合成减少,PCNA下调。结论:胆汁酸通过上调TGR5的表达促进肠上皮细胞增殖。
【关键词】：梗阻性黄疸 肠黏膜屏障 胆汁内引流 胆汁酸 胆汁酸受体TGR5 细胞增殖
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575
【目录】：

• 中文摘要5-10
• 英文摘要10-18
• 英文缩写18-20
• 引言20-22
• 第一部分 胆汁对梗阻性黄疸患者肠黏膜屏障的作用及TGR5表达的影响22-51
• 前言22-23
• 材料与方法23-35
• 结果35-37
• 附图37-43
• 附表43-45
• 讨论45-47
• 小结47-48
• 参考文献48-51
• 第二部分 胆汁酸对梗阻性黄疸大鼠肠黏膜屏障的作用及TGR5表达的影响51-74
• 前言51-52
• 材料与方法52-64
• 结果64-66
• 附图66-69
• 附表69-70
• 讨论70-71
• 小结71
• 参考文献71-74
• 第三部分 胆汁酸通过上调TGR5表达促进肠上皮细胞增殖74-104
• 前言74-75
• 材料与方法75-86
• 结果86-91
• 附图91-100
• 讨论100-102
• 小结102
• 参考文献102-104
• 结论104-105
• 综述 胆汁酸膜受体TGR5研究进展105-125
• 参考文献116-125
• 致谢125-126
• 个人简历12

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